抗蓝舌病病毒15型vp2蛋白的单克隆抗体btv15-vp2-2d6及其识别的b细胞表位和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，尤其涉及一株分泌抗蓝舌 病病毒15型VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体；本发明还涉及 一个B细胞表位，尤其涉及由上述单克隆抗体所识别的蓝舌病病毒15型VP2蛋白B细胞表 位；本发明还涉及上述杂交瘤细胞株、单克隆抗体以及B细胞表位在制备鉴别诊断不同血 清型蓝舌病病毒以及预防和治疗蓝舌病相关试剂和药物中的应用，本发明属于蓝舌病的防 治领域。
【背景技术】
[0002] 蓝舌病（Bluetongue，BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属的成员蓝舌病病毒 (Bluetonguevirus，BTV)引起的，经由其传播媒介库蠓通过吸血途径在反会动物之间进行 广泛传播的虫媒性急性、烈性动物传染病。其易感动物主要有绵羊、山羊、水牛、黄牛、鹿、骆 驼等反刍动物，其中绵羊、山羊最易感。通常只有绵羊被感染后才表现出明显典型的发病症 状，其主要表现为：体温升高至40. 5-41. 4摄氏度；口腔黏膜发绀充血；嘴唇、眼睑、面部水 肿；大量流涎、呕吐、下痢。蓝舌病发病急，传染性较强，造成反刍动物的高死亡率，对大动 物养殖业以及动物经济市场造成了严重的损失。所以我国将蓝舌病划规为一类疫病，世界 动物卫生组织将其列为须通报动物疫病。由于传播媒介库蠓生活的季节性和地域性，所以 蓝舌病主要分布于非洲、欧洲、亚洲、北美、南美和大洋洲的多个热带、亚热带和温带地区国 家。蓝舌病最早于18世纪被发现于南非的绵羊，由于发病绵羊持续高热后出现口腔黏膜损 失以及舌头发蓝，蓝舌病因此而得名。1940年前本病还仅发现于撒哈拉以南的非洲大陆，比 如埃及（1907年）、肯尼亚（1909年）、西非（1927年）、塞浦路斯、巴勒斯坦、土耳其、叙利亚 (1943-1949 年）。
[0003] 而后，欧洲、美洲及亚洲都相继报道该病的爆发。而我国是在1979年在云南省师 宗县首次分尚出蓝舌病病毒，而报道蓝舌病在中国的爆发，之后在湖北省（1983年）、安徽 省（1985年）、四川省（1989年）、山西省（1991年）相继爆发此病。有关学者通过对我国 多个省区蓝舌病血清型进行分析调查，结果鉴定出BTV-1、2、3、4、12、15以及16血清型。我 国流行的蓝舌病血清型即为1、2、3、4、12、15以及16型。进入21世纪以来，在全球温室效应 的催化作用下，蓝舌病传播媒介库蠓也广泛地活跃于相关地区，蓝舌病也以流行范围更广、 发生频率越大、并且毒力更强的趋势爆发于世界各地。但是由于蓝舌病病毒血清型众多，且 基因容易发生飘移等特征，使得目前并没有统一有效确实的治疗措施来预防或是治疗蓝舌 病，所以制备出针对某一特定血清型的蓝舌病病毒相关试剂刻不容缓，我们应当未雨绸缪 通过储备好相关试剂，以更快、更有效地方式抵御蓝舌病的侵害，最大化地减少畜牧业的经 济损失以及保卫公共卫生安全。
[0004] 蓝舌病病毒（Bluetonguevirus,BTV)属于呼肠孤病毒科环状病毒属的成员，是呼 肠孤病毒科中最大的一类病毒。其病毒粒子呈20面体对称，病毒粒子直径为70-80nm，无囊 膜，基因组为10个分节段大小不等的双股RNA，分别编码7个结构蛋白VP1~VP7和四种非 结构蛋白NSl、NS2、NS3/NS3a以及NS4。病毒粒子外层衣壳由VP2和VP5构成，大约占病毒 总蛋白的40% ;核衣壳由VP3和VP7以及三种次要结构蛋白VP1、VP4以及VP6共同构成。 病毒基因组包含在病毒双层衣壳中。其中，60个口袋状结构的VP2蛋白聚体位于病毒粒子 的最外层。VP2由L2基因编码，不同血清型L2长度和保守性差异是最大的。VP2是血清型 特异性抗原，主要作用是刺激中和抗体产生，也是病毒血凝素抗原。所以，VP2是BTV血清 型的主要决定因素。目前，已经确定BTV有26个血清型。不同血清型之间交叉保护效力较 差。而我国流行的主要血清型是1、2、3、4、12、15以及16型，目前还未有针对BTV15的单克 隆抗体。所以，本发明针对BTV15-VP2制备的杂交瘤细胞以及相应的单克隆抗体及其B细 胞抗原表位对于建立BTV15型的快速鉴别诊断以及预防和治疗15型蓝舌病提供了一定的 技术储备。
【发明内容】
[0005] 本发明目的之一是提供一株分泌抗蓝舌病病毒15型VP2蛋白单克隆抗体的杂交 瘤细胞株；
[0006] 本发明目的之二是提供一种由该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，该单克隆抗 体可与BTV15VP2蛋白发生特异性反应；
[0007] 本发明目的之三是提供一种BTV15VP2蛋白的特异性B细胞表位。
[0008] 本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0009] 本发明利用PMAL-C4X原核表达系统表达纯化的重组的BTV15VP2蛋白作为免疫 原免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，以Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统表达纯化的重组BTV15VP2蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法筛选 杂交瘤细胞，最终获得一株稳定分泌抗BTV15VP2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命 名为：BTV15-VP2-2D6,分类命名为：分泌抗BTV15-VP2-2D6单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏号为：CGMCC No. 10206,保藏时间为：2014年12月23日；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院中 科院微生物研究所。
[0010] 此外，本发明还提供了一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，命名为 BTV15-VP2-2D6,IFA检测结果表明该杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与BTV15感染BHK细胞 产生的VP2蛋白发生特异性反应，而与相应阴性对照不发生反应。
[0011] 进一步的，本发明利用肽扫描技术对BTV15-VP2-2D6所识别的BTV15VP2蛋白的B 细胞表位进行了鉴定，结果表明：BTV15-VP2-2D6所识别的BTV15VP2蛋白的线性B细胞表 位的氨基酸序列为9IERNSTIAPAIIKRYP24(SEQIDN0. 1所示）。同时，序列比对特异性鉴定 结果显示9IERNSTIAPAIIKRYP24为BTV15型特异性表位，S卩BTV15血清型特异性抗原表位。
[0012] 综上所述，本发明制备并鉴定出了一种特异性针对BTV15VP2蛋白的单克隆抗体、 该抗体所识别的BTV15VP2蛋白的B细胞表位以及稳定分泌该单克隆抗体杂交瘤细胞株，研 究证明本发明的单克隆抗体以及单克隆抗体所识别的针对BTV15特异性的B细胞表位可用 于制备特异性血清型BTV15型的鉴别诊断试剂以及预防或治疗BTV15型感染的药物。
【附图说明】
[0013] 图1为原核表达及纯化的重组BTV15VP2蛋白的SDS-PAGE与Westernblot鉴定；
[0014] Μ:标准蛋白Marker1 :空载体pMAL-C4X表达蛋白；2 :BTV15VP2蛋白诱导前；3 : BTV15VP2蛋白诱导超声后上清；4 :BTV15VP2蛋白诱导超声后沉淀；5 :纯化后的BTV15VP2 蛋白；6 :纯化的BTV15VP2蛋白（WB) ;7 :未纯化的BTV15VP2蛋白（WB);M:标准蛋白Marker。
[0015] 图2为真核表达及纯化的重组BTV15VP2蛋白的SDS-PAGE与Westernblot鉴定；
[0016] Μ:标准蛋白Marker1 :Sf9细胞；2 :野生型杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞；3 : 重组杆状病毒感染的Sf9细胞；4 :纯化的真核表达的BTV15VP2蛋白；5 :纯化的真核表达 的BTV15VP2蛋白（WB) ;6 :重组杆状病毒感染的Sf9细胞（WB) ;7 :Sf9细胞；Μ:标准蛋白 Marker〇
[0017] 图3为应用IFA检测单克隆抗体BTV15-VP2-2D6与BTV15感染的BHK细胞以及与 未感染BTV15的BHK细胞的反应结果；
[0018] 1.BTV15-VP2-2D6与BTV15感染的BHK细胞之间的反应；2.小鼠阳性血清与BTV15 感染的BHK细胞之间的反应；3.BTV15-VP2-2D6与未感染BTV15的BHK细胞之间的反应。
[0019] 图4为原核表达的10条截短蛋白的SDS-PAGE分析；
[0020] Μ:标准蛋白Marker;V:空载体pMAL?-c4X表达的蛋白；1-10 :表达的10条VP2截 短蛋白B15-VP2-1 ~B15-VP2-10。
[0021 ] 图5为原核表达的14条16氨基酸短肽的SDS-PAGE分析；
[0022] Μ:标准蛋白Marker;V:空载体pMAL?-c4X表达的蛋白；