人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞工程技术领域，特别涉及一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充 质干细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 骨髓间充质干细胞（Mesenchymaistemcells，MSCs)，是在骨髓中的一种类似成 纤维细胞的一类细胞，具有多方向分化潜能，可以向骨组织、软骨组织、皮肤、造血干细胞支 持介质、骨骼肌细胞及心肌细胞转化。自体骨髓间充质干细胞还具有取材方便、无免疫原 性、具有多向分化潜能、合乎伦理学要求并且无致瘤性，具有其它干细胞不可比拟的优势， 因此，探讨MSCs体外大量扩增具有深远意义。
[0003]目前骨髓间充质干细胞的体外扩增多采用二维培养方式进行的，也有部分采用三 维细胞培养支架进行培养，但均是采用单一的三维细胞培养支架，由于单一的三维细胞培 养支架存在机械性能弱，不稳固等问题，因此，在培养过程中，容易从三维细胞培养支架的 三维培养方式转变成二维培养方式，从而使得骨髓间充质干细胞活性差，扩增不明显。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中采用单一的三维支架培养骨髓间 充质干细胞的方法因支架机械性能弱，不稳固，生物相容性差等造成骨髓间充质干细胞扩 增率不高、细胞活性差等缺陷，提供一种能够采用两种及以上三维支架的人工模拟骨髓微 环境进行骨髓间充质干细胞的培养方法。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种人工模拟骨髓微环境培养 骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
[0006] 获取骨髓间充质干细胞，采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；
[0007] 其中，所述三维细胞培养支架由骨基质明胶、壳聚糖季铵盐水凝胶和脱细胞软骨 匀浆中的至少两种材料制成。
[0008] 在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，获取骨髓 间充质干细胞的步骤包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细 胞，PBS缓冲液离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。
[0009] 在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，获取骨髓 间充质干细胞的步骤还包括对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养的过程，包括以下步 骤：将原代骨髓间充质干细胞浓度调整至1X1〇6~1X10 8个/25ml，加入所述培养基进行 培养；当细胞生长到融合时，PBS漂洗，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入 含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1 :2~1 :3比例接种进行传代培养至细胞生长到融 合，继续传代至获得第三代骨髓间充质干细胞。
[0010] 在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，采用三维 培养支架进行体外培养的步骤为：取三维培养支架复溶，取第三代骨髓间充质干细胞，PBS 清洗，胰酶-EDTA消化，以1X10s~1X101(]L1细胞浓度与复溶后三维培养支架共同接种于 所述培养基中进行培养。
[0011] 在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，三维培养 支架复溶过程中，还添加有助溶剂。
[0012] 在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述助溶 剂为乙醇，且乙醇的质量分数为5% -15%。
[0013] 在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述培养 基为血清培养基，且所述血清培养基中添加有10 6~10smol/L的氢化可的松、80-120U/ml 的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。
[0014] 在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述壳聚 糖季铵盐水凝胶的制备过程为：按1:2~1:5的质量比将壳聚糖与2, 3-环氧丙基三甲基 氯化铵于70~95°C水浴中反应7-10小时，加入无水乙醇，析出壳聚糖季铵盐，将壳聚糖季 铵盐再溶于乙醇中凝胶化，即获得壳聚糖季铵盐水凝胶。
[0015] 在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述三维 细胞培养支架由0. 2~lg的骨基质明胶和0. 2~lg的壳聚糖季铵盐水凝胶组合而成；
[0016] 或，所述三维细胞培养支架由0. 2~lg的骨基质明胶和15_50g/L的脱细胞软骨 匀浆组合而成；
[0017] 或，所述三维细胞培养支架由0. 2~lg的壳聚糖季铵盐水凝胶和15_50g/L的脱 细胞软骨匀衆组合而成。
[0018] 在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述三维 细胞培养支架由〇. 2~lg的骨基质明胶、0. 2~lg的壳聚糖季铵盐水凝胶和15-50g/L的 脱细胞软骨匀浆组合而成。
[0019] 实施本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，可以达到 以下有益效果：通过采用骨基质明胶、壳聚糖季铵盐水凝胶和脱细胞软骨匀浆中的两种或 两种以上的组合作为三维培养支架，不仅能够维持模拟骨髓微环境的三维多孔结构，而且 能够提高骨髓间充质干细胞的吸附能力及生长增殖能力等，从而提高了骨髓间充质干细胞 的增殖率及细胞活性，解决了现有技术中，采用单一三维培养支架培养骨髓间充质干细胞 存在支架生物相容性差，机械性能弱等缺陷造成细胞活性差、易死亡、增殖率低等问题。
【具体实施方式】
[0020] 为解决现有技术中采用单一的三维细胞培养支架培养骨髓间充质干细胞存在细 胞活性差，增殖率低等缺陷，本发明的创新点在于提供一种采用两种及以上的三维细胞培 养支架以人工模拟骨髓微环境进行培养骨髓间充质干细胞的方法，避免了单一的三维细胞 培养支架生物相容性差，机械性能弱，不稳固等问题，从而可真正实现骨髓间充质干细胞的 三维培养，不仅能够提高骨髓间充质干细胞的活性，而且还能够提高骨髓间充质干细胞的 扩增率。
[0021] 具体地，本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括 以下步骤：
[0022] S1、获取骨髓间充质干细胞；
[0023] S2、采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；其中，三维细胞培养支架是 由骨基质明胶、壳聚糖季铵盐水凝胶和脱细胞软骨匀浆中的两种或两种以上材料组合制成 的。
[0024] 进一步地，步骤S1中还包括原代骨髓间充质干细胞的获取，及原代骨髓间充质干 细胞的传代培养，具体为：
[0025] S11、原代骨髓间充质干细胞的获取：
[0026] 采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，加入PBS缓冲 液，离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。
[0027] S12、对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养至第三代骨髓间充质干细胞：
[0028] 将原代骨髓间充质干细胞调整至1X106~1X108个/25ml，加入培养基进行培养， 优选地，该培养基为血清培养基，且血清培养基中添加有10 6~10smol/L的氢化可的松、 80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。当细胞生长到融合时，PBS漂洗2~3次， 加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按 1 :2~1 :3比例传代接种培养至细胞生长至IJ融合，重复上述操作继续传代，艮PPBS漂洗2~ 3次，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消 化，按1 :2~1 :3比例传代接种培养至细胞生长到融合，即获得第三代骨髓间充质干细胞。
[0029] 步骤S2