一种纯化制备n-磺酰氨甲酰基毒素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物检测领域，具体的说涉及一种纯化制备N-磺酰氨甲酰基毒素 的方法。
【背景技术】
[0002] 麻痹性贝类毒素（PSTs)是水体中浮游藻类或微生物产生的一类水溶性极强 的小分子次生代谢产物。其基本结构是两个胍基的四水化嘌呤多叠六元环。根据取代 基团的不同，主要分为四类：①氨基甲酸酯类毒素（Carbamatetoxins)，包括石房蛤毒 素（Saxitoxin，STX)、新石房蛤毒素（neoSTX，ΝΕ0)和膝沟藻毒素l_4(Gonyautoxins， GTX1-4);②N-磺酰氨甲酰基类毒素（N-sulfocarbamoyltoxins)，包括GTX5 (B1)、 GTX6(B2)和C1-C4 ;③脱氛甲醜基类毒素（Decarbamoyltoxins)，包括dcSTX、dcneoSTX、 dcGTXl-4;④脱氧脱氛甲醜基类毒素（Deoxydecarb-amoyltoxins)，包括doSTX、doneoSTX 和doGTXl等。
[0003]PSTs是一类高效的钠离子通道神经毒素。当人体摄入了被PSTs污染的海产品 后，临床初期主要表现为嘴、唇、舌发麻，四肢出现麻痹症状，感觉出现异常，人变得虚弱和 混乱；后期主要表现为恶心，呕吐，呼吸急促，头痛发烧，吞咽困难，血压异常，严重者出现意 识模糊甚至死亡。N-磺酰氨甲酰基类毒素虽然其本身毒性较小，但是在生物体内极易通过 生物转化脱去磺酰基和氨基甲酸酯链生成毒性很强的STX和脱氨甲酰基类毒素。另外，最 新的生物转化实验也发现并确认了在贝类水产品体内存在C1/C2毒素。
[0004] 为保障公众不受PSTs的威胁，世界许多国家、地区及相关国际组织都已经对贝类 水产品进行严格管理和控制，并制定了相应的贝类水产品及其制品的PSTs限量标准。但 PSTs标准品价格昂贵，因此相关毒素标准品制备与纯化技术受到尚度关注。
[0005] 由于毒素来源的不稳定性，PSTs纯化技术一直是该类毒素定量与定性分析的重 点和难点。目前PSTs纯化的毒素主要来源是天然海域中分离纯化得到的产毒藻株。但有 很大一部分藻株不具备培养条件，已有报道培养条件并能够小规模化养殖的产毒藻种只有 A.catenella、A.tamarense(AT，塔玛亚历山大藻）和A.minutum等少数几个。但是对产毒 藻AT的培养仍然没有系统的、最佳的方法。
[0006] 因此有必要建立了一种可以制备纯化N-磺酰氨甲酰基类毒素方法，为相关水产 品质量安全监管提供技术支持。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种纯化制备N-磺酰氨甲酰基毒素的方法，该方法包括 如下步骤：
[0008] (1)产毒藻的培养：将AT的纯藻株在无菌条件下接入含营养盐的人工海水中，纯 藻株液和人工海水体积比为1:2,在f/2培养基、温度23°C、盐度2. 8-3. 2% (优选的盐度为 3. 0% )、pH7. 5-8. 5(优选的pH为8. 0)、光强160001ux和光暗比14L:10D的条件下进行 藻株的培养，培养时间5天；
[0009] (2)毒素的提取：藻液经0.22μπι滤膜抽滤，取膜上的藻体以体积比为1 :2加入提 取液，室温提取两次，每次10min，4500rpm离心lOmin后合并两次提取液，-20°C冷冻4h弃 去上层乙腈层，即得到毒素的粗提液；其中提取液为乙腈、水和甲酸按照80 :19. 9 :0. 1的体 积比配制而成；
[0010] ⑶毒素的收集与纯化：取粗提液〇. 5mL进入GPC(G-15)纯化系统，在0. 1%乙酸 为流动相的等度条件下洗脱，流速设为2. 50mL/min，设置流出液的收集时间，用自动收集器 收集；收集得到的流出液冷冻干燥至尽干并用〇. 1 %乙酸定容至lmL，过0. 22μm滤膜，进 LC-MS/MS对产毒种类进行定性；采用HPLC-FLD柱后衍生-峰面积归一法计算毒素纯度。
[0011] 其中步骤（3)中所使用的液相分析条件具体如下：
[0012] 色谱柱：TSK-gelAmide-80 亲水柱（150X2mm，3ym);柱温：30°C;流速：0· 3mL/ min;进样量：5μL;
[0013] 流动相：A相：乙腈；B相：3. 6mM甲酸、2mM甲酸铵水溶液（pH3. 5);
[0014] 梯度洗脱程序：0min, 15%B;0-10min，45%B;10-llmin，45%B;ll-14min，15% B, 14-19,min15%B〇
[0015] 步骤（3)中所使用的质谱分析条件具体如下：
[0016] 离子源模式：正离子模式（ESI+);喷雾电压：4.Okv(ESI+);加热块温度：300°C;离 子传输管温度：350°C;鞘气：氮气，流量35arb;辅助气：氮气，流量20arb;碰撞气：氩气，碰 撞压力1. 5mTorr;毒素的质谱参数见表1。
[0017] 步骤（3)中所使用色谱及衍生条件如下：
[0018] 色谱柱：AgleaVenusilXBPC8 (4. 6X150mm，5μm);流动相（等度）：2mM四丁基 磷酸铵水溶液（10%乙酸或1 %氨水单向调节pH至5.8);流速：0. 8mL/min;柱后衍生剂： lOOmM磷酸+5mM高碘酸水溶液（5MNaOH调节pH至7. 8)，流速0. 4mL/min;酸化剂：0. 75M 硝酸，流速〇. 4mL/min;柱温：20°C;衍生池温度：85°C;荧光检测器参数：激发波长：330nm; 发射波长：390nm;进样量：10μL〇
[0019] 本发明还提供了一种塔玛亚历山大藻的培养方法，将AT的纯藻株在无菌条件下 接入含营养盐的人工海水中，纯藻株液和人工海水体积比为1:2,在f/2培养基、温度23°C、 盐度2.8-3.2%(优选的盐度为3.0%)、？!17.5-8.5(优选的？!1为8.0)、光强1600011?和 光暗比14L:10D的条件下进行藻株的培养，培养时间5天。
[0020] 本发明通过优化塔玛亚历山大藻的培养条件，使得其能够保持最高活力进行增 殖，进而产生最大量的PSTs，此株藻种能产生C1/C2以及GTX2/GTX3四种PSTs的组分，其中C2含量最高，可达到90%以上；经葡聚糖凝胶G-15纯化后，将C1/C2与GTX2/3完全分离； 通过调整收集时间可以得到纯度在91%以上的C1/C2。此技术与现有技术相比，方法简单， 毒素纯度较高。
【附图说明】
[0021] 图1为毒素粗提液经葡聚糖凝胶G-15进行毒素纯化的回收率。
[0022] 图2为毒素纯化后的C1/C2HPLC-FLD色谱图。
【具体实施方式】
[0023] 下面给出的实施例对本发明作进一步的说明。本发明是结合最佳实施例进行描述 的，然而在阅读本发明实例后，本领域技术人员能领会并在公开的实施中做许多改变也可 获得相同或类似的结果，均属于本发明的构思和范围。更具体的说，有些试剂可替代本文所 公开的试剂而得到相同或类似结果。所有类似的取代或修饰均被认为本发明的构思和范 围，所有上述等价形式均属于本发明权利要求书限定的范围。
[0024] 实施例1
[0025] 1、材料与方法
[0026] 1. 1主要仪器与试剂
[0027]LC-MS/MS:电喷雾离子源（ESI)(ThermoFisherScientific，USA);
[0028]HPLC柱后荧光衍生系统：Watersalliance2690/2475 (Waters，USA);
[0029]凝胶过滤系统：J2preplincGPC/SPE/evap联用仪（J2scientific，USA);
[0030] 培养箱：PQX_350H人工气候箱，上海申贤恒温设备厂；
[0031] 数字式PH计：PHS-3C，上海雷磁仪器厂；
[0032] 冷冻干燥机：HetoPowerDryLL3000,上海汇分电子科技有限公司；
[0033] 细胞粉碎机：GA98-IIIDB，无锡上佳生物科技有限公司；
[0034] 手持折光仪：0TC，上海天皇仪器仪表有限公司。
[0035] 1.2标准品及试剂
[0036] 毒素标准品（STX，NEO,GTX1/4,GTX2/3,C1/C2)购自加拿大国家研究理事会海洋 生命科学研究院；甲酸、乙腈、乙酸和葡聚糖凝胶G-15购自国药化学试剂有限公司。
[0037] 塔玛亚历山大藻种：分离自中国东海长江口海域，由厦门大学近海海洋环境科学 国家重点实验室提供；
[0038]f/2 培养基的配制参考文献Guillard,R.R.L. 1975.Cultureofphytoplankton forfeedingmarineinvertebrates,pp26-60.InSmithff.L.andChanleyΜ.H. (Eds.) CultureofMarineInvertebrateAnimals.PlenumPress,NewYork,USA
[0039]2、实验方法
[0040] 2· 1产毒素藻株培养方法
[0041] 将AT的纯藻株在无菌条件下接入含营养盐的人工海水中，纯藻株液和人工海水 体积比为1:2,在f/2培养基、温度23°C、盐度3. 0%、ρΗ8. 0、光强160001ux和光暗比14L: 10D的条件下进行藻株的培养，培养时间5天。
[0042] 2. 2毒素提取方法
[0043] 藻液经0.22μπι滤膜抽滤，取膜上的藻体以体积比为1 :2加入80%的乙腈水（体 积比：乙腈+水+甲酸=80 :19. 9 :0. 1)，室温提取两次，每次10min，4500