肌醇六磷酸酶的利记博彩app
【专利说明】肌醇六磯酸酶 阳OOU 序列表
[0002] 此申请通过USPTOEFS-W邸服务器电子提交，如在MPEP§ 502. 05中授权并提出， 并且此电子申请包括电子提交的序列表；此序列表的全部内容在此通过引用并入此申请的 说明书。在电子提交的ASCIICtxt)文档文件上确定序列表如下：
发明领域
[0004] 提供具有肌醇六憐酸酶活性的多肤和编码肌醇六憐酸酶的多核巧酸序列。具体而 言，序列提供了具有高比活性、高热稳定性、高耐热性的肌醇六憐酸酶增加水平的表达，和 肌醇六憐酸酶的各种工业用途。
【附图说明】
[0005] 图1 :W纯化的蛋白在肌醇六憐酸（pH5. 5)上测定比活性扣/mg)。毕赤酵母表 达的肌醇六憐酸酶：SEQIDN0:8(由沈QIDN0:7编码）、沈QIDN0:3(由沈QIDN0:2 编码）和SEQIDN0:6(由SEQIDNO:5编码），和假单胞菌表达的肌醇六憐酸酶：SEQID N0:3(由沈QIDN0:1编码）和沈QIDN0:6(由沈QIDN0:4编码）。
[0006] 图2 :在IOOmM的巧樣酸盐抑5. 5+10%的山梨醇-10%的化Cl中肌醇六憐酸酶 沈QIDN0:3(由沈QIDNO: 1编码）的DSC色谱图。
[0007] 图3 :肌醇六憐酸酶在有和没有10%的山梨醇-10%的化Cl的IOOmM巧樣酸盐抑 5. 5 中的DSCTm值（°C)。沈QIDN0:3(由沈QIDN0:1 编码）和沈QIDN0:6(由沈QID N0:4编码）为假单胞菌表达的。SEQIDN0:3(由SEQIDN0:2编码）、SEQIDN0:6(由 SEQIDN0:5编码）和SEQIDN0:8(由SEQIDN0:7编码）为毕赤酵母表达的。
[0008] 图4 :在4mM的肌醇六憐酸上使用化itton-Robinson"通用"缓冲液，肌醇六憐酸 酶的抑曲线。沈QIDN0:3(由沈QIDN0:1编码）和沈QIDN0:6(由沈QIDN0:4编 码）为假单胞菌表达的。SEQIDN0:3(由SEQIDN0:2编码）和SEQIDN0:6(由SEQID N0:5编码）为毕赤酵母表达的。
[0009] 图5 :受到SGF+胃蛋白酶处理的肌醇六憐酸酶的SDS-PAGE。沈QIDN0:3(由 SEQIDNO: 1编码）和SEQIDN0:6(由SEQIDN0:4编码）为假单胞菌表达的。SEQID N0:3(由沈QIDN0:2表达）、沈QIDN0:6(由沈QIDN0:5表达）和沈QIDN0:8(由沈Q IDNO:7表达）为毕赤酵母表达的。
[0010] 图6 :经过SGF处理的热稳定的肌醇六憐酸酶的活性。观察到热稳定的肌醇六憐 酸酶活性最小或无损失。在加入肌醇六憐酸酶之前使用pH11的缓冲液预泽灭TO样品。
[0011] 图7 :肌醇六憐酸酶发酵（30L)的假单胞菌（P.f.)表达水平。
【具体实施方式】
[0012] 肌醇六憐酸酶是憐的单醋水解酶，其催化肌醇六憐酸（肌醇六憐酸盐）水解为憐 和肌醇。根据国际生物化学和分子生物学联盟（IUBMB)命名委员会和BairocM.的"2000 年的ENZYME数据库"，Nucleic Acids Res 28:304-305(2000)的介绍，肌醇六憐酸酶被分类 为酶学委员会巧C)编号EC 3. 1. 3. 8,并且还被称为：1-肌醇六憐酸酶；肌醇六憐酸盐3-憐 酸水解酶；肌醇六憐酸1-憐酸酶；肌醇六憐酸3-憐酸酶；或肌醇六憐酸6-憐酸酶。肌醇 六憐酸酶还被分类为EC 3. 1. 3. 26,其也被称为：4-肌醇六憐酸酶；6-肌醇六憐酸酶（基于 比-编号系统而不是ID-编号命名）；或肌醇六憐酸6-憐酸酶。肌醇六憐酸酶还被分类为 EC3. 1.3. 72,其也被称为5-肌醇六憐酸酶。肌醇六憐酸酶还被称为组氨酸憐酸酶（HAP); 0-螺旋奖肌醇六憐酸酶；紫色酸性憐酸酶（PAP) ; W及蛋白酪氨酸憐酸酶（PTP)。肌醇六 憐酸酶的替代名称对本领域技术人员将是已知的。
[0013] 肌醇六憐酸酶是可在动物饲料颗粒中具有作为补充物功效的酶的实例。肌醇六憐 酸酶使肌醇六憐酸降解为肌醇核和一个或多个游离的憐酸盐分子。肌醇六憐酸由肌醇核组 成，六个憐酸盐基团共价结合至该肌醇核。肌醇六憐酸是植物材料诸如大豆种子的成分，其 用于产生用于动物的饲料颗粒，诸如非反当动物，例如家禽、肉鸡、鸟类、鸡、蛋鸡、火鸡、鸭、 碟和飞禽（fowl);反当动物，例如母牛、家畜、马和羊；家猪（pig)、猪（swine)、小猪、生长猪 和母猪；宠物包括但不限于：猫、狗、晒齿动物和兔子；鱼包括但不限于大马哈鱼、娃鱼、罗 非鱼、餘鱼和經鱼；W及甲壳类动物包括但不限于河邮和明邮。因为运些动物不能消化肌醇 六憐酸，所W肌醇六憐酸具有许多有害的影响。它馨合二价阳离子，诸如巧和儀，并且它的 憐酸盐对于被饲养的动物是生物学上不可利用的形式，导致需要用运些营养物补充动物饮 食，尽管它们在原料中是丰富的。而且，因为运些营养物经过动物而未经消化，所W它们对 于能够降解肌醇六憐酸的食物链更加向下的分解者是可W利用的，例如，导致与动物流出 物接触的地表水中的藻类水华。
[0014] 非反当动物，诸如鸡、家猪和鱼，不能够从食物中获取快速生长所需的充足的憐， 由于它们不能自然地产生从食物中发现的肌醇六憐酸释放憐所必需的肌醇六憐酸酶。因为 大部分的憐W肌醇六憐酸的憐酸基团（肌醇六憐酸盐）的形式存在，所W仅少量来自基于 植物的食品和种子的憐被利用。因此，为了增加它们的生长，存在为动物提供憐的需要。
[0015] 一种方案是向动物饲料添加无机憐补充物；然而，使用无机憐补充物导致由动物 排泄并进入环境的憐酸盐的量增加，运导致水源的污染。
[0016] 另一种方案是为动物提供肌醇六憐酸酶补充物或添加肌醇六憐酸酶至动物饲 料。商业上可得到的肌醇六憐酸酶产品的实例包括但不限于：PHYZYME值upont、Danisco、 Genencor) !QUANTUM和FINA沈（AB Vista、AB Enzymes) ;NATUP册S度ASF) ;R0N0ZYME值SM); Biofeed肌醇六憐酸酶（Novo Nordisk) ;Allzyme肌醇六憐酸酶（Alltech); OPTIP册S巧nz;yvia、Phytex、Cornell) ;Rov油io(Adisseo) ;PHYT0UT(US Waters)。运些肌 醇六憐酸酶产品中的每个至少在生产水平、生产时间、高溫稳定性、低抑稳定性、比活性和 剂量要求中具有限制。因此，对于肌醇六憐酸酶存在需要，例如，在较少时间内W较高产率 生产的肌醇六憐酸酶、在高溫下保持更多活性的肌醇六憐酸酶、在低抑下保持更多活性的 肌醇六憐酸酶或具有较高比活性的肌醇六憐酸酶，较高比活性的肌醇六憐酸酶使得使用者 能够减少剂量水平并减少为动物饲料生产和提供肌醇六憐酸酶的成本。
[0017] 肌醇六憐酸酶是由核酸序列编码的蛋白质。核酸序列或DNA被克隆进入宿主有 机体，其能够表达或生产肌醇六憐酸酶。本领域中存在可用于生产蛋白质的多种已知的蛋 白质表达系统。蛋白质表达系统的实例包括有机体诸如：细菌、酵母菌、霉菌、哺乳类、植物 或昆虫。各种因素影响表达系统的选择，诸如被表达的蛋白的类型和生产的蛋白质产品的 量。Demain, (2009)"ProductionofRecombinantproteinsbyMicrobesandhigher organisms",BiotechnologyAdvances,第27卷，第297-306页公开了多种蛋白表达系统的 各种优点和缺点。
[0018] 商业上肌醇六憐酸酶从多种宿主有机体细胞外生产，宿主有机体包括但不限于： 黑曲霉、米曲霉、绳状青霉、肌醇六憐酸酶油菜（甘蓝型油菜）、毕赤酵母和粟酒裂殖酵母， 参见Pariza,"Determiningthesafetyofenzymesusedinanimalfeed",Regulatory ToxicologyandPharmacology56 (2010)332-：M2。
[0019] 肌醇六憐酸酶的工业规模生产需要W低成本在少量时间内产生高水平的酶的表 达系统。因此，对提供满足或超出工业规模制造肌醇六憐酸酶的生产需求的基因存在需要。
[0020] 本发明的一个实施方式是提供编码在革兰氏阴性细菌表达系统中W高水平生产 的肌醇六憐酸酶的基因。另一个实施方式是提供编码经由细胞内表达W高水平生产的肌醇 六憐酸酶的基因。另一个实施方式是在革兰氏阴性细菌表达系统中经由细胞内表达生产肌 醇六憐酸酶，其中宿主有机体是假单胞菌。另一个实施方式是在巧光假单胞菌中生产肌醇 六憐酸酶。表达系统可W为本领域已知的任何巧光假单胞菌表达系统，例如，从Dow Global Technologies Inc.商业上可得的巧光假单胞菌表达系统，菌株DC454(美国专利公开申请 号20050130160和美国专利公开申请号20050186666)。将编码肌醇六憐酸酶或多肤的核酸 序列插入pMYC载体值OW Global Technologies Inc.，美国专利公开申请20050130160)或 pD0W1169载体值OW Global Technologies Inc.，美国专利公开申请号20080058262)的任 何一个中，然后通过电穿孔将其引入巧光假单胞菌宿主。本领域技术人员将知道可用作本 发明的实施方式的可选载体。
[0021] 在另一个实施方式中，编码肌醇六憐酸酶的DNA可被引入例如任意数目的革兰氏 阴性细菌系统的质粒上或被稳定地转化为例如任意数目的革兰氏阴性细菌系统的基因组， 革兰氏阴性细菌系统诸如大肠杆菌、假单胞菌种类诸如巧光、恶臭假单胞菌、铜绿假单胞 菌、雷尔氏种类（Ralstoniaspecies)或柄细菌种类。类似地，肌醇六憐酸酶可被引入任 意数目的革兰氏阳性细菌表达系统，诸如，杆菌种类诸如枯草芽抱杆菌、巨大芽抱杆菌，或 短杆菌乳球菌种类诸如乳酸乳球菌、乳酸杆菌种类，或链霉菌种类诸如变铅青链霉菌。其它 革兰氏阴性、革兰氏阳性或非相关的真菌的或古细菌的表达系统可被用于表达肌醇六憐酸 酶。
[0022] 在另一个实施方式中，编码肌醇六憐酸酶的DNA可被引入质粒W指导其表达。 包含编码肌醇六憐酸酶的DNA的质粒可包括，例如P犯、pET和pASK家族的大肠杆菌表 达载体；PCN51LT8、RSF1010、PWZ112T和pMYC家族的假单胞菌表达载体；pBAX、pHTOl和 抑IS1525家族的杆菌表达载体；PIJ6021和PIJ2460家族的链霉菌表达载体；和PNZ9530和 PNZ8148家族的乳酸菌表达载体，例如。运些实例是为了说明性目的，并不代表在其中可表 达SEQIDNO: 1的多核巧酸序列的完整的载体组。
[0023] 在另一个实施方式中，可W至少 7. 0g/l、8. 0g/l、9. 0g/l、10. 0g/l、11.0g/l、 12. 0g/L、13. 0g/L、14. 0g/L、15. 0g/L、16. 0g/L、17. 0g/L、18. 0g/L、19. 0g/L、20.Og/L、 21. 0g/L、22. 0g/L、23. 0g/L、24. 0g/L、25. 0g/L、26. 0g/L、27. 0g/L、28.0g/L、29.Og/L、 30. 0g/L、31. 0g/L、32. 0g/L、33. 0g/L、：M. 0g/L、35. 0g/L、36. 0g/L、37. 0g/L、38.Og/L、 39.Og/l、或至少40.Og/L或大于40.Og/L的水平通过细胞内表达生产编码肌醇六憐酸酶的 分离的、重组的或合成的核酸序列。
[0024] 在另一个实施方式中，肌醇六憐酸酶的发酵生产时间为小于150小时、145小时、 140小时、135小时、130小时、125小时、120小时、115小时、110小时、105小时、100小时、95 小时、90小时、85小时、80小时、75小时、70小