一种检测鱼腥藻磷代谢相关酶基因表达量引物及应用与方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种检测鱼腥藻FACHB-1299憐代谢相关酶 基因表达量引物及应用与方法。
【背景技术】
[0002] 蓝藻是一类古老的具有放氧光合作用的革兰氏阴性细菌，在漫长的自然选择过程 中进化出独特的环境适应能力，广泛分布于不同的生境中。蓝藻对不利的环境因子，如溫度 变化、营养（如氮源和憐源等）缺乏、氧化胁迫等，产生的特异性应答反应是蓝藻适应多变 的环境、提高蓝藻的生态竞争优势的重要途径之一。因此，蓝藻对不同的环境因子产生特异 性应答反应的机制成为人们关注的焦点，并尝试利用蓝藻细胞对重要的环境因子产生特异 性的应答反应的生物学特性监测蓝藻水华发生。
[0003] 憐是蓝藻细胞膜与细胞核核酸的主要组成成分，同时又是细胞中高能化合物ATP、 ADP的基本组成元素，在能量传递和转化中起着重要作用。水体中憐通常是蓝藻生长的限制 性营养成分。在憐饥饿条件下，为满足自身生命活动对憐的需求，机体会增加憐的吸收，在 分子水平上，无机憐饥饿胁迫将诱导憐饥饿诱导基因的表达，运些基因包括一系列参与转 运Pi、含憐复合物的蛋白基因W及参与憐代谢的蛋白基因，如憐酸转运蛋白酶基因PStl和 碱性憐酸酶基因地oA-1化e。
[0004] 由于水体中的憐元素可WW各种有机或无机，溶解或颗粒物的形式出现，所W测 定水体生物有效态的憐对水质富营养化程度监测和藻华爆发预警有重要意义。传统上许多 国家往往从化学分析的角度评估水质和水生态健康状况。化学分析方法通过复杂的仪器设 备理论上可W快速而灵敏地监测任何化学物质，但是运些仪器分析技术并不能测定化合物 的生物危害和生物有效性。采用生物检测技术具有多方面的优势：首先生物检测技术可W 提供污染的前期预警，从而采取补救措施避免污染；此外，生物方法还可W帮助评估化合物 在复合污染情况下的生物效应。
[0005]目前国际上尚没有利用生物方法检测生物有效憐的相关专利，不过国外已经有人 采用基于碱性憐酸酶的方法来评估水体中的生物有效憐。碱性憐酸酶是一类可W将水中含 憐的有机分子水解并释放出可W吸收形态憐的胞外酶，基于碱性憐酸酶的憐含量测定方法 是利用紫外分光光度法通过测定碱性憐酸酶的酶活性来确定憐含量，运种方法有效但是相 对繁琐而且费时。因此，通过对本±藻类物种的生长过程进行研究，开发基于憐代谢相关酶 基因相对表达量获得水体生物有效憐含量的测定方法，利用本±藻类物种从分子生物学水 平对水体生物有效憐含量进行测定，将为我国环境监测和管理部口在水体富营养化监测与 水华爆发预警等领域的科技应用和技术提升提供坚实的基础。
【发明内容】
[0006] 1、发明要解决的技术问题
[0007] 为了解决目前国际上尚没有很好地利用生物方法检测生物有效憐的相关专利，而 且已有的基于碱性憐酸酶活性测定的方法来评估水体中的生物有效憐相对繁琐而费时的 问题，本发明提供了一种通过检测本±藻类物种鱼腥藻FACHB-1299憐代谢相关酶基因表 达量来获得水体生物有效憐含量的分子生物学测定方法。
[000引 2、技术方案
[0009] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
[0010] 一种检测鱼腥藻憐代谢相关酶基因表达量的引物，为W下两对引物中的一对或两 对，其中一对引物用于检测憐酸转运蛋白酶基因pstl，该引物的上游序列如序列表SeqID No. 1所示，下游序列如序列表SeqIDNo. 2所示，PStl基因的DNA序列如序列表SeqID No. 5所示；另一对引物用于检测碱性憐酸酶基因地oA-1化e，该引物的上游序列如序列表 SeqIDNo. 3所示，下游序列如序列表SeqIDNo. 4所示，phoA-like基因的DNA序列如序 列表SeqIDNo.6所示；
[0015] 本发明还提供了该检测鱼腥藻憐代谢相关酶基因表达量的引物的应用，该引物可 W用于测定水体生物的有效憐含量，测得的水体生物有效憐含量可用于监测水质富营养化 程度从而加强藻华爆发预警。
[0016] 本发明还提供了一种通过检测鱼腥藻憐代谢相关酶基因表达量来测定水体生物 有效憐含量的方法，具体包括如下步骤：
[0017] 步骤一：培养在环境样品中生长，并在0. 05,0. 25,0. 5,1，2mg/L五个不同憐浓度 梯度下驯化的鱼腥藻，；
[001引步骤二：提取鱼腥藻样品的RNA，反转录为CDNA;
[0019] 步骤S:将步骤二所得CDNA梯度稀释后作为标准模板，W引物为引导进行实时巧 光定量PCR，绘制标准曲线，设置阔值；
[0020] 步骤四：W待测环境样品的CDNA为模板，对内参基因进行实时巧光定量PCR扩增， 获得相应的Ct值，计算内参基因的表达量2&AU,用于后续待检测水体生物样品CDNA浓度 的校正；
[0021] 步骤五：利用引物与步骤四同时对待检测环境样品的CDNA进行实时巧光定量PCR 扩增，根据反应结果确定环境样品对应的Ct值；
[0022] 步骤六：W2 法计算憐代谢相关酶基因的相对表达量，憐浓度W2为底数取对 数值作为X，憐代谢相关酶基因相对表达量W10为底数取对数值作为y，作xy曲线图，并画 对数趋势线，获得对数趋势线公式及R值；
[0023] 步骤屯：将环境样品的憐代谢相关酶基因相对表达量W 10为底数取对数值作为y 代入公式，获得X，W2为底数取指数值得到环境样品中生物有效憐含量。
[0024] 进一步地，通过检测鱼腥藻憐代谢相关酶基因表达量来测定水体生物有效憐含量 的方法中的引物为用于检测憐酸转运蛋白酶基因PStl的引物和/或用于检测碱性憐酸酶 基因地oA-1化e的引物。
[00巧]进一步地，通过检测鱼腥藻憐代谢相关酶基因表达量来测定水体生物有效憐含量 的方法步骤四中的内参基因为16S，扩增内参基因的引物序列如序列表SeqIDNo.7-8所 示：
[0028] 进一步地，通过检测鱼腥藻憐代谢相关酶基因表达量来测定水体生物有效憐含量 的方法步骤一中的不同憐浓度梯度为0. 05,0. 25,0. 5,l，2mg/L五个梯度。
[0029] 本发明还提供了一种通过检测鱼腥藻的憐代谢相关酶基因表达量来测定水体生 物有效憐含量的试剂盒，包括检测用引物、巧光定量PCR混合液，其特征在于，所述引物包 括：
[0036] 进一步地，本发明试剂盒的反应是在Applied Biosybkn-柄！St巧化e实时巧光定 量PCR仪上进行的；反应体系为：2 XMaster Mix IOy L含有化g/y L鱼腥藻cDNA模板 2 y L 0. 2mmol/L引物0. 4 y L加灭菌超纯水至20 y L ;实时巧光定量PCR反应的扩增程序 为：95°C 15s，60°C Imin,再从65°C连续升溫至95°C，每升高0. 3°C收集巧光1次，最后降溫 至40°C ;最后，在AppliedBiosyste!化、皮的Step One Software软件中2. Ivision自动生成 扩增产物的烙解曲线。
[0037] 3、有益效果
[0038] (1)本发明采用生物检测技术可W提供污染的前期预警，从而采取补救措施避免 污染；
[0039] (2)本发明所采用的生物检测技术可W帮助评估化合物在复合污染情况下的生物 效应；
[0040] (3)本发明的技术可W测定水体中生物有效态的憐，通过水体生物有效憐含量来 监测水质富营养化程度，运对藻华爆发预警有重要意义。
【附图说明】
[0041] 图1为憐浓度W 2为底数取对数值作为x，pstl基因相对表达量W 10为底数取对 数值作为y的对数趋势线。
[0042] 图2为憐浓度W 2为底数取对数值作为X，phoA-like基因相对表达量W 10为底 数取对数值作为y的对数趋势线。
【具体实施方式】
[0043] 下面结合说明书附图对本发明创造作进一步说明。下述实施方法中的实验方法均 为常规方法，所设及实验材料均为常规生化试剂。
[0044] 实施例I:
[0045] 本发明的具体操作如下：
[0046] 1.材料与方法
[0047] 1. 1供试材料：
[0048]W常用采水器采集水样比，用0. 45ym微孔滤膜过滤，除去藻类和细菌，高溫高压 灭菌采集得到环境样品；
[0049] 所用纯藻种购买于武汉中科院水生生物研究所淡水藻种库，系统编号为 FACHB-1299,所用培养基为BGll(成分见下表）
[005。将纯藻种从试管转入灭过菌的小S角瓶中（20-50血)，转接2/3藻种，转接时藻 液：培养基为1 : 2。放置到光照培养箱中培养，溫度为25°C，光照强度为2000LUX，周期为1化昼1化夜。培养二周左右。二周后观察，如生长较好后，再次进行转接，比例为1: 5至 1:6扩大培养，得到所用藻液。
[0052] 将生长到对数生长期（0〇72。二0.8~1. 0)的鱼腥藻FACHB-1299细胞W6000巧m， 离屯、Smin收集，然后用BGll-Pi洗两遍，再重悬在相同的培养基中生长，使培养物的终 浓度伽72。）为0. 05,W等摩尔的KCl替代K2HPO4,培养条件为：溫度为25°C，光照强度为 2000LUX，周期为1化昼1化夜。将缺憐培养至第3天的鱼腥藻FACHB-1299W6000巧m，离 屯、Smin收集，分别转至环境样品和不同憐浓度梯度培养基中生长，其中包括0. 05,0. 25， 0. 5,1，2mg/L五个憐浓度梯度，培养条件为：溫度为25°C，光照强度为2000LUX，周期为12h 昼1化夜。生长2小时后将鱼腥藻FACHB-1299细胞W6000巧m，离屯、Smin收集。
[005引 1. 2试验方法：
[0054] 1. 2. 1 总RNA的提取
[00巧]按照试剂盒说明书提取不同憐浓度下培养的鱼腥藻FACHB-1299样品的RNA。用核 酸蛋白紫外分析仪检测A260/A280的比值W鉴定RNA抽提质量，1. 8《A260/A280《2. 0， 表明总RNA质量较好，同时测定其标