高效分泌表达黑曲霉α-半乳糖苷酶AGA的工程菌及其构建和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术和基因工程领域，具体设及高效分泌表达黑曲霉a-半乳糖 巧酶AGA的工程菌及其构建和应用。
【背景技术】
[0002] a-半乳糖巧酶（a-galactosidase，EC3. 2. 1. 22)是一类外切糖巧酶酶，广泛存 在于动植物及微生物中（Vianaetal.，2006)，能特异性水解半乳糖巧类的非还原性末端 a-1,6-半乳糖巧键，如蜜二糖、棉巧糖、水苏糖等寡糖类QaekooLee, 2012)。基于W上特 点，a-半乳糖巧酶在食品、饲料、化工、造纸、医药等方面都有很重要的应用价值。
[0003] 在食品工业中，a-半乳糖巧酶可用于制糖工业中糖蜜的棉巧糖分解，提高产率和 效率；也可W用于豆奶的发酵，水解豆奶中易造成胃胀的蜜=糖和水苏糖等多聚寡糖，从而 获得低a-半乳糖巧基寡糖含量的豆奶制品，有利于人体消化（Patiletal.，2010)。
[0004] 在饲料工业中，a-半乳糖巧酶可W作为一种特异性外源饲用酶，添加到含有豆类 巧实和饼巧的饲料中，有效降解a-半乳糖巧类寡糖物质，提高饲料利用率，消除由a-半 乳糖巧类物质引起的单胃动物肠道食糜滞留，导致肠道胀气，消化素乱，下频等抗营养作用 畑lazietal. , 2003)。 阳0化]在医药和化学工业中，a-半乳糖巧酶可W用于治疗法布里病（F油巧'sHRiera etal. , 2015)和B- 0血型转换（Zhangetal. , 2007);另外，a-半乳糖巧酶可W对环糊 精改性，增加环糊精的亲水性，提高环糊精对化学分子的包埋及缓释效率。
[0006] 在造纸工业中，a-半乳糖巧酶可W与甘露聚糖酶协同作用，提高纸浆的漂白效率 任uchartetal. , 2000)。
[0007] 虽然a-半乳糖巧酶应用范围广且具有众多优点，但目前国内外的a-半乳糖巧 酶均存在生产水平较低，稳定性较差等缺点，急需提高酶发酵水平，因此需要利用现代生物 工程技术，提高酶的分泌表达量，W满足众多领域的需要。
[0008] 酵母表达系统具有生长快、操作简单，利于大规模发酵生产等优点，同时真核生物 能对表达的外源蛋白质进行必要的翻译后修饰，使得表达的蛋白具有生物学活性等优点。 研究发现，毕赤酵母遗传背景清晰，易于基因工程操作；与日常生活密切，安全，无毒素，对 生物和环境不会构成威胁；可进行蛋白翻译后加工；可进行分泌表达，易于纯化；发酵工艺 简单，原料成本低廉，因此建立a-半乳糖巧酶高效分泌表达的毕赤酵母菌株具有良好的 经济效益和社会效益。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供高效分泌表达黑曲霉a-半乳糖巧酶AGA的工程菌及其构 建和应用。
[0010] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0011] 一种a-半乳糖巧酶AGA的毕赤酵母密码子优化序列，毕赤酵母密码子优化序列 reAGA为沈Q ID N0:3所示。
[0012] 一种高效分泌表达黑曲霉a-半乳糖巧酶AGA的毕赤酵母工程菌，其特征在于工 程菌为携带SEQ ID N0:3所示毕赤酵母密码子优化序列reAGA及Kex2蛋白酶切位点突变 的毕赤酵母突变体。
[0013] 所述携带Kex2蛋白酶切位点突变的突变体为Kex2蛋白酶切Pl'位点的E86突变 为I的有效突变体E86I，其DNA序列分别为SEQ ID N0:6。
[0014] 所述携带Kex2蛋白酶切位点突变的突变体为Kex2蛋白酶切Pl'位点的E86突变 为P的有效突变体E86P，其DNA序列分别为SEQ ID NO: 7。 阳01引其，DNA序列沈Q ID N0:6对应的蛋白序列为沈Q ID N0:8 ;DNA序列沈Q ID N0:7 对应的蛋白序列为SEQ ID N0:9。
[0016] 一种高效分泌表达黑曲霉a-半乳糖巧酶AGA的毕赤酵母工程菌的构建方法：
[0017] 1)将经优化的黑曲霉a-半乳糖巧酶AGA基因序列密码子reAGA克隆至载体，得 含有沈Q ID N0:4碱基序列的重组质粒pPICZ a A-reAGA ; 阳0化]。W上述获得重组质粒pPICZaA-reAGA为模板，Kex2Pr位点定点突变的引物 对，进行全质粒PCR，获得重组质粒pPICZ a AX-reAGA ;
[0019] 3)将上述获得重组质粒pPICZ a AX-reAGA转化毕赤酵母细胞，即获得毕赤酵母工 程菌。
[0020] 所述Kex2Pr位点定点突变的引物对为：
[0040] 一种a-半乳糖巧酶AGA的毕赤酵母密码子优化序列的应用，所述优化序列在高 效分泌表达黑曲霉a-半乳糖巧酶AGA中的应用。
[0041] 一种高效分泌表达黑曲霉a-半乳糖巧酶AGA的毕赤酵母工程菌的应用，所述工 程菌在高效分泌表达黑曲霉a-半乳糖巧酶AGA中的应用。
[0042] 本发明的有益效果在于：（1)通过毕赤酵母分泌表达系统获得重组黑曲霉a-半 乳糖巧酶AGA;2)密码子优化后，高效表达重组黑曲霉a-半乳糖巧酶AGA，表达产物的酶 学活性和商品a-半乳糖巧酶活性相当。3)本发明通过定点突变Kex2酶切位点，优化了重 组a-半乳糖巧酶的分泌效率，提高了酵母表达体系中重组黑曲霉a-半乳糖巧酶AGA的 表达量，从而具有降低工业生产a-半乳糖巧酶成本，大规模发酵，商业化生产重组黑曲霉 a-半乳糖巧酶AGA的潜力和价值。
【附图说明】 阳0创图IA为本发明实施例提供的reAGA基因的PCR产物电泳图， W44]图IB为本发明实施例提供的reAGA基因的PCR产物的酶切电泳图，其中，泳道M为DNAMarker，图IA泳道1为reAGA的PCR产物；图IB泳道1，2为pPICZaA-reAGA的双 酶切巧coRI和NotI)产物。
[0045] 图2为为本发明实施例提供的重组质粒pPICZ a A-reAGA的构建过程示意图。
[0046] 图3为为本发明实施例提供的pPICZaAX-reAGA转化子在高抗筛选平板上的生长 情况图。
[0047] 图4为为本发明实施例提供的pPICZ a AX-reAGA重组转化子菌落PCR验证图。 W48] 图5为为本发明实施例提供的工程菌摇瓶发酵表达a-半乳糖巧酶后酶活性测定 图。
[0049] 图6为为本发明实施例提供的酶产量较高的毕赤酵母工程菌QIBEBT-AGA-I与 QI邸BT-AGA-P表达上清与Kex2酶切位点未优化的原始菌株（NA)SDS-PAGE比较图。
[0050] 图7为为本发明实施例提供的毕赤酵母工程菌QI邸BT-AGA-I，QI邸BT-AGA-P发酵 罐（2L)发酵甲醇诱导12化后酶活柱状图。
【具体实施方式】
[0051] 下面将结合实施例W及图1-图7所示，对本发明作进一步的阐述。但本发明并不 局限于此，凡依照本发明公开内容所作出的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。
[0052] 实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA 片段连接、酶切、定点突变，凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参 见《分子克隆实验指南》（第S版）（SambrookJ,RussellDW，Janssen!(,ArgentineJ.黄 培堂等译，2002,北京：科学出版社），或按照制造厂商所建议的条件。
[0053] 实施例中所用毕赤酵母（Pichiapastoris)KMTl购自Invitrogen公司。黑曲霉菌 株和pPICZaA表达载体（Invitrogen公司）为本实验室保存。
[0054] 实施例1 阳化引 1.黑曲霉a-半乳糖巧酶AGA基因序列的获得（SEQIDNO: 1):
[0056]从NCBI网站上捜索黑曲霉a-半乳糖巧酶AGA序列（GenBankAccession No.AJ251873. 1)。 阳057] 2.黑曲霉曰-半乳糖巧酶AGA部分密码子优化后序列reAGA的获得佛QID NO:3)：
[0058] 1)分析沈QIDNO:1，将序列按照酵母密码子偏好性化ttp://www.kazusa.or.jp/ codon),进行密码子优化。同时在前面和后面加入EcoRI和NotI酶切位点，得到优化后 reAGA序列（SEQIDN0:3)。合成上述基因片段，克隆到载体PUC57上，得PU巧7-reAGA。
[0059] 3.分泌表达型重组质粒pPICZaA-reAGA的构建 W60] 将pPICZaA和合成的PU巧7-reAGA经EcoRI和NotI双酶切，产物经纯化，用T4DNA连接酶在25°C水浴中进行连接，然后将连接产物转化大肠杆菌畑5a菌株。用通用 引物5'AOXl和3'AOXl引物对转化菌落经菌落PCR鉴定后测序验证，从而得到重组质粒 pPICZaA-reAGA(如图 1 和图 2)。 W61] 4.分泌表达型重组质粒pPICZaAX-reAGA的构建
[00创 W上19对引物分别作为引物，W重组质粒pPICZaA-reAGA为模板，分别通过全质 粒PCR，PCR条件为：98°C3min;98°C30s;65°C30s;68°C6min;循环 36 次；68°C15min。获 得重组质粒pPICZaAX-reAGA，即将Kex2酶切位点突变为19种不同的氨基酸；PCR产物经 过化nl酶切，将模板DNA降解，然后分别转化大肠杆菌畑5a菌株。提质粒经过测序验证， 从而获得Kex2酶切位点突变为19种不同的氨基酸的重组质粒pPICZaAX-reAGA。所述重 组质粒pPICZaA-reAGA中包含酿酒酵母a因子分泌信号肤序列和kex2蛋白酶切位点，其 C端融合了密码子优化后的基因序列reAGA，得到序列为SEQIDN0:4,其对应的蛋白序列如 沈QIDNO:5所示。 阳06引所述19对引物为：
[0084] (I)制备毕赤酵母KM71感受态细胞 阳0化]①接种毕赤酵母KM71单菌落至2mlYro液体培养基中，30°C、250巧m，摇瓶培养约 lOh。
[0086] ②转接50yL活化的毕赤酵母KM71菌液到50血Yro液体培养基中，30°C、250巧m， 摇瓶培养至ODe。。为1. 3-1. 5左右，将菌液收集在提前4°C预冷的50血离屯、管中。
[0087]③4°C、500化pm、3min，离屯、收集菌体细胞，用40血预冷的无菌水轻轻吹吸悬浮细 胞。
[00蝴④4°C、5000巧m、3min，离屯、收集菌体细胞，用10-20血预冷的无菌水悬浮细胞。
[0089] ⑥4°C、500化pm、3min，离屯、收集菌体细胞，用10-20血预冷的IM山梨醇轻轻吹吸 悬浮细胞。
[0090] ⑧4°C、500化pm、3min，离屯、收集菌体细胞，用200yL预冷的IM山梨醇悬浮细胞， 分装到EP管中，每管100JiL。 阳0川 似转化pPICZaAX-reAGA质粒