一种快速区分hp-prrs活疫苗jxa1-r株与野毒株的hrm检测方法及其引物的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明设及病毒野毒株与疫苗毒株的鉴别方法，具体设及一种快速区分高致病性 猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检测方法及其引物。
【背景技术】
[0002] 高致病性猪繁殖与呼吸综合征（Hi曲pathogenicporciner巧roductive andrespiratorysyn化ome，HP-PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV，porcine r巧roductiveandrespiratorysyn化omevirus)变异株引起的一种急性高致死性疫病， 该变异株称为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV)。发病主要特征为怀孕母猪 流产、早产、木乃伊胎等，母猪流产率可达30%W上；仔猪出现严重的呼吸道症状，感染率可 达100%，死亡率在50%W上。目前我国主要采取W疫苗免疫为主的综合性防控措施，对猪实 施强制免疫，使用的高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗均为活疫苗(江西株JXA^R、湖南株 Hun4-F112、天津株TJM-F92、广东株GDrlSO)。
[0003] 由于高致病性猪蓝耳病疫苗种类较多，再加上国内外学者与养猪企业对HP-PRRS 疫苗使用观点的差异，导致我国目前猪蓝耳病疫苗的使用非常混乱，多种疫苗株的同时使 用很可能会导致疫苗株间的同源重组，导致疫苗株毒性返强的可能。对发病猪病原检测，有 效、尽早地诊断是疫苗株或是疫苗株返强引起的猪蓝耳病，还是野毒感染引起猪体发病，对 于猪场有效控制及最大限度减少经济损失具有重要意义。目前还没有一种有效鉴别高致病 性猪蓝耳病野毒株与疫苗株的检测方法。针对江西株JXA1-R的检测方法目前有巧光探针 法报道(魏津.等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（JXA1-R株）病毒含量巧光定量 PCR方法的建立[J].中国兽药杂志，2013，47(10): 39-42)，针对JXA1野毒株与JXA1-R 疫苗株的鉴别诊断有PCR方法的报道(何玲，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒变异野毒株 与JXA1-R疫苗毒株快速鉴别方法的建立[J].中国畜牧兽医，2011，38(1): 198-201)。 但针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株鉴别诊断方法的报道还没 有。所W建立一种快速有效的鉴别高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒 株的检测方法具有重要的意义。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述存在的问题，本发明利用JXA1-R株和高致病性猪繁殖与呼吸综合 征野毒株（HP-PRRSV)的单核巧酸多态性进行高分辨率烙解曲线分析（hi曲-resolution meltanalysisofsinglenucleotidepolymorphisms，SNP-HRM)，建立区分JXAl-R疫苗 毒株和HP-PRRSV野毒株SNP-HRM分型方法。
[0005] 本发明的目的在于提供一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 JXA1-R株与野毒株的HRM检测引物。
[0006] 本发明的目的在于提供一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 JXAl-R株与野毒株的HRM检测方法。
[0007] 本发明的再一目的在于提供一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 JXA1-R株与野毒株的HRM检测试剂盒。
[0008] 本发明所采取的技术方案是： 一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检测方 法的引物，其核巧酸序列如下所示： 引物P1:TCGCCRCGGGAGTCTGR(沈QIDN0:1)， 引物P2:RGCGGAAACTTTGACCACTT(沈QIDN0:2)，引物口3^6464464664174〔66(：1'(569 10側：3)， 引物P4:GGCCTGGTTGGGATCATAAG(沈QIDN0:4)。
[0009] 一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXAl-R株与野毒株的HRM试 剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。
[0010] 一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株的HRM检 测方法，包括W下步骤： 1) 从样品中提取病毒核酸； 2) W核酸为模板，用权利要求1所述的引物对P1和P2进行预扩增反应获得预扩增产 物； 3) W预扩增产物作为DNA模板，用权利要求1所述的引物对P3、P4及巧光饱和染料进 行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物； 4) 对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型。
[0011] 进一步的，步骤2)中PCR预扩增反应体系为： 模板RNA 1化 PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0. 5化2X1 Step Buffer 6. 25化 引物PI0.5化 引物P2 0.5化 Syto9 0. 5化 RNase化66 d地2〇 3. 75化 总体积 13化。
[0012] 进一步的，步骤2)中的预扩增反应程序为：50°C反转录30min ;95°C预变性3min ; 95°C变性40s，56°C退火40s，72°C延伸60s ;循环35次。
[0013] 进一步的，步骤3)中的PCR-HRM扩增反应体系为： pH 8. 0的2XBuffer 10. 0化 MgClz 2. 8化 dNTPs2. 0化 引物P3 0.5化 引物P4 0. 5化 Syto9 0. 5化 1. 0 UTaqHS0. 2化 模板DM 1.0化 dd&O 2. 5化 总体积 20化。
[0014] 进一步的，步骤3)中的PCR-HRM扩增反应程序为：95°C预变性5min;95°C变性 20s，55°C退火 20s，72°C延伸 20s;循环 35 次；98°C变性 2min，40°C杂合 2min，60°C到 85°C W0. 3°C/s的烙解速率进行烙解曲线分析。
[0015] 进一步的，步骤4)中所述HRM分析的具体分析过程为：分别W72°C~74°C和 84°C~86°C溫度区间作为JXA1-RPCR-HRM扩增产物烙解曲线归一化溫度区间，并分别W HP-PRRSV野毒株和JXA1-R疫苗毒株质粒样品为阳性对照对临床样品进行基因分型；与 HP-PRRSV野毒株阳性对照进行比较时，若其基因分型置信值GCP大于或等于95%则判定为 HP-PRRSV野毒株；与JXA1-R疫苗毒株阳性对照进行比较时，若其基因分型置信值GCP大于 或等于95%则判定为JXA1-R疫苗毒株。
[0016] 本发明的有益效果是： 1)本发明首次建立了一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与 野毒株的HRM检测方法及其引物，操作简单：只需在PCR反应之前加巧光饱和染料即可；检 测速度快且高通量：全部操作过程只需3小时，极大缩短了分型所需时间；费用低，不需要 特异性巧光标记探针，每个样品的饱和染料成本为1. 6RMB;准确性高、特异性好，重复性 好，可W准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。
[0017] 2)本发明的PCR-HRM引物，对HP-PRRSV活疫苗JXA1-R株与野毒株，均有很好的扩 增性，有助于提高PCR的效率，减少病毒鉴别分型的时间。
[001引 3)本发明的PCR-HRM引物特异性好，除可W与HP-PRRSV活疫苗JXA1-R株与野毒 株结合外，不与其他常见猪源病毒，如猪攝病毒（classicalswinefevervirus,CSFV)、 猪伪狂犬病毒（Pseudor油iesVirus,PRV)、猪圆环 2 型（Porcinecircovirustype2, PCV2)、猪细小病毒（Porcineparvovirus,PPV)等核酸结合，特异性扩增PRRSV核酸，有利 于提高本发明对PRRSV经典和变异毒株分析的正确性。
[0019] 4)本发明利用套式PCR方法来提高区别HP-PRRSV活疫苗JXA1-R株与野毒株的准 确性和重复性。
【附图说明】
[0020] 图1为JXA1-R疫苗毒株和HP-PRRSV野毒株（HP-PRRSVGDI)SNP-HRM分析方法 归一化(A)和峰型化（B)烙解曲线图； 图2为JXA1-R疫苗毒株和HP-PRRSV野毒株（HP-PRRSVGDI)SNP-HRM分析方法临床样 品归一化（A)和峰型化（B)烙解曲线图；其中样品JXA1-R疫苗株和HP-PRRSV野毒株（GDI) 分别作为阳性对照； 图3为本发明方法检测并区分JXA1-R疫苗毒株和HP-PRRSV野毒株（PRRSVGDI)的特 异性试验结果； 图4为本发明方法检测JXA1-R疫苗毒株的灵敏度试验结果。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0022] 实施例1 一种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株与野毒株 的HRM检测方法 引物 1)PCR预扩增引物 根据HP-PRRSV疫苗株JXA1-R和HP-PRRSV野毒株基因序列设计出扩增疫苗株JXA1-R和野毒株部分基因片段的引物对P1和P2(PCR预扩增引物)，其碱基序列如下所示。
[0023] P1 :TCGCCRCGGGAGTCTGR(沈Q ID NO :1)， P2:RGCGGAAACTTTGACCACTT(沈QIDNO:2); 其中R为简并碱基，为碱基A或G; 2)PCR-HRM引物： 经过对所设计的大量引物进行筛选后，发现引物碱基序列SEQIDNO:3和SEQIDNO: 4对PCR-HRM方法区分HP-PRRSV疫苗株JXAl-R和HP-PRRSV野毒株的效果最好，其碱基序 列如下所示。
[0024]P3：TGAGAAGAGGATTACGGCT(SEQIDNO：3), P4:GGCCTGGTTGGGATCATAAG(沈QIDN0:4)。
[00巧]实施例2 -种快速区分高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXAl-R株与野毒株 的HRM检测方法 标准样品的PCR-HRM分析 1)HP-PRRSV标准品核酸的提取： 将JXA1-R疫苗加入3mLPBS盐酸缓冲溶液进行溶解得JXA1-R疫苗样品溶液，准备好 感染过GDI野毒株（HP-PRRSV野毒株）的猪血清样品，分别取该2种样品各200yL并按 TAKARA的Mini邸STViralRNA/DNAExtractionKitVer. 4.0 的说明书进行样品中核酸的 提取。
[0026] 2 )阳性标准样品的PCR-HRM操作步骤 为了验证所设计的引物对实际样品的鉴别能力，本研究利用JXA1-R疫苗（JQ804986) 和GDI野毒株（HP-PRRSV野毒株，KR056088)作为标准样品进行PCR-HRM分析。分别W上 述标准样品提取核酸作为核酸模板，分别进行PCR-HRM预扩增反应、PCR-HRM扩增反应和分 析。
[0027] 2. 1RT-PCR预扩增 参照PrimeScript?OneStepRT-PCRKit产品说明书，按W下组成配制RT-PCR反应 液。引物P1/P2为区分PRRSV经典毒株和变异毒株的预扩增引物：
预扩增反应程序为50°C反转录30min;95°C预变性3min;95°C变性40s，56°C退火40s， 72°C延伸60s;循环35次。
[0028] 2. 2PCR-HRM分析 将引物P1/P2预扩增产物稀释100倍后作为模板，WP3/P4为引物进行第2轮不对称PCR扩增，PCR-HRM扩增反应体系如下