利用miR397a提高植物中酚类化合物含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域和遗传育种领域，具体地说，设及一种利用miR397a 提高植物中酪类化合物含量的方法。
【背景技术】
[0002] 丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参（SalviamiItiorrhizaBunge)的干燥根及根 茎，具有活血调经、桂疲止痛的功效，临床上可用于屯、脑血管疾病、癌症及慢性肝炎、尿毒症 等疾病的治疗。目前世界上W丹参为原料的药品和保健品在市场上所占份额越来越大，如 复方丹参滴丸、复方丹参注射液等近百种产品，已达到数百亿元，且1997年复方丹参滴丸 成为第一个向美国FDAW治疗药身份申报的品种，表明丹参首例用国际标准进行评价的传 统中药，应用前景十分广阔。
[0003] 根据化合物的结构特点和理化性质，可W将丹参的化学成分为两类：一类为脂溶 性的丹参酬类化合物，如丹参酬（Tanshinone)I和丹参酬IIA等；一类为水溶性的酪酸类 化合物，如迷迭香酸和丹酪酸B等。其中，W丹参水溶性物质为主的复方丹参注射液、丹参 素注射液等制剂越来越受到人们的欢迎。其中，丹参水溶性药用成分中W丹酪酸B的含量 最高，2005年版和2010年版《中华人民共和国药典》均将丹酪酸B作为丹参药材质量控制 的指标性成分；迷迭香酸具有抗炎、镇痛、解痛的功效，在植物中的分布较为广泛，主要存在 于唇形科、紫草科、葫芦科等多种植物中，且已经研发成药物，于1990年在德国投放市场； 原儿茶醒和丹参素在丹参中的含量也较高，具有很强的抗脂质氧化、抗肝纤维化、改善尿毒 症等作用，二者常作为丹参原药材W及丹参制剂的质量控制指标成分，也是丹参治疗冠屯、 病的主要有效成分。
[0004] 近年来，随着丹参药材需求量的迅速增加和野生资源的减少，人工栽培丹参的品 质良莽不齐，因此，如何从分子水平上提高丹参中酪类化合物的含量，培育优质品种已成为 丹参资源开发中新的研究方向。经检索发现，国内外科学家采用组织培养和细胞工程、非生 物诱导子诱导、基因工程技术等方式对提高丹参酪类物质的含量进行研究。通过组织培养 和细胞工程、非生物诱导子诱导提高的酪类物质含量升幅不大，且随着继代次数的增加，含 量逐渐降低，稳定性不高。采用转基因技术提高丹参中迷迭香酸和丹酪酸B的含量，仅为野 生型丹参干燥根中迷迭香酸和丹酪酸B含量的1. 15和1. 79倍，因此，通过转基因技术进行 丹参品种的稳定改良还有很大的提升空间。
【发明内容】
阳0化]本发明的目的是提供一种利用miR397a稳定提高植物，特别是丹参中酪类化合物 含量的方法。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明首先提供miR397a在提高植物中酪类化合物含量中 的应用。
[0007] 所述应用具体为：在植物中过表达miR397a，获得酪类化合物含量提高的转基因 株系。
[0008] 前述的应用，所述植物包括丹参。
[0009] 本发明还提供一种miR397a过表达载体，所述过表达载体上含有由强启动子驱动 的miR397a基因cDNA序列（SeqIDNo. 1，下划线为miR397a成熟体序列）。
[0010] 其中，所述过表达载体的出发载体为植物双元表达载体（优选为地1121)，所述强 启动子优选为CaMV35S。
[0011] 本发明构建的miR397a过表达载体CaMV35Sp: :miR397a的结构如图1所示。
[0012] 本发明还提供含有所述过表达载体的工程菌和转基因细胞系。
[0013] 本发明还提供所述过表达载体在制备转基因植物中的应用。
[0014] 本发明进一步提供一种利用miR397a提高植物中迷迭香酸和丹酪酸B等酪类化合 物含量的方法，将所述过表达载体转入植物中获得酪类化合物含量提高的转基因植株。其 中，所述植物包括丹参。
[0015] 优选地，利用农杆菌介导的方法将所述过表达载体转入植物中。采用冻融法将过 表达载体转化农杆菌，具体步骤如下：
[0016] 1)将GV3101农杆菌感受态细胞置于冰上，待其融化后向管中加入2-6 iiL质粒 CaMV35Sp: :miR397a，使其充分混匀后置于冰上5min，然后再将管放于液氮中速冻5min，完 成后迅速将管放于37°C的金属浴中热击5min;
[0017] 2)完成后将上述混合液加入1血LB液体培养基中，28 °C慢速振荡2-4h;
[0018] 3)将振荡后的离屯、管取出，常溫下3000巧m离屯、4min，弃掉一部分上清液，留约 200yL菌液用涂布棒均匀涂在含化f和Kan(浓度分别为200mg/L和50mg/L)的LB固体平 板上，然后倒置放于28°C的恒溫培养箱中培养2地；
[0019] 4)在超净工作台中用已灭菌的枪头从平板上挑选3-6个农杆菌单菌落，分别加入 含LB液体培养及（含Rif和Kan)的离屯、管中，28°C振荡过夜培养；
[0020] 5)用移液器将农杆菌菌液吸取ImL加入1. 5mL干净的离屯、管中，然后再向其中加 入已灭菌的0. 5mL甘油（浓度为50% )，充分混匀后保存于-80°C冰箱，用于后续植物转化 实验。
[0021] miR397a是microRNA的一种，为长度21bp的内源性非编码RNA，在植物进化中高 度保守，具有重要的调控功能。丹参具有基因组小，染色体少，生长条件简单，且已经初步完 成基因组测序等特点，正在发展成为潜在的模式药用植物，因此miR397a在丹参中的作用 研究对其他植物有一定的指导借鉴意义。
[0022] 用质粒CaMV35Sp: :miR397a对丹参进行遗传转化，具体方法如下：根据对993品 系丹参转化体系的摸索，将ODe。。值为0. 5的农杆菌ImL稀释20倍侵染生长状态良好的丹 参叶片，侵染时间为5min，在SmTl固体培养基中25°C暗培养2天后，转入SmT2固体培养基 25°C下光培养1化暗培养化，每10天继代一次，直到长出小芽，将小芽剪下，转入SmT3固体 培养基中诱导生根，直至培养成植株。
[0023]其中，SmTl培养基：MS+BAP1.Omg/L+NAA0.Img/L
[0024] SmT2培养基：MS+BAP1. Omg/L+NAA0.Img/L+Cef200mg/L+Kan50mg/L 阳0巧]SmT3培养基：1/2MS+Cef2〇Omg/L
[00%] 前述的方法，用于PCR鉴定转基因植株的引物组合为：
[0027]miR397a-5F:5' -CGCACAATCCCACTATCCTTCGCAA-3'
[0028] miR397a-5R:5< -CGCTGCACTCAATGATGGTTCTCCA-3'
[0029]miR397a-3F:5' -GCCCAATGGTACCAGACAAGTCAA-3'
[0030]miR397a-3R:5< -CAAGACCGGCAACAGGATTCAATCT-3'
[0031] 利用UFLC-QTrap-MS/MS技术分别测定转基因植株（例如，转基因丹参株系）的 根、茎和叶中酪类化合物的含量，结果显示，与野生型植株相比，酪类化合物在转基因植株 中的含量较野生型对照植株有不同程度的提高，尤W丹酪酸B和迷迭香酸含量提高程度较 大。
[0032] 本发明通过构建miR397a过表达载体并获得丹酪酸B和迷迭香酸等酪类化合物含 量提高的转基因植株（例如，转基因丹参株系1-7)，为更好地探讨miR397a在酪类化合物生 物合成中的功能提供依据，同时也为植物的分子育种及品质成因奠定了理论基础。
【附图说明】
[0033] 图1为本发明实施例1中构建的过表达载体CaMV35Sp: :miR397a的结构示意图。
[0034] 图2为本发明实施例3中miR397a转基因丹参的PCR检测电泳结果；A图中M:DNA 分子量标准；P:表达载体目的基因5'端序列的阳性克隆；1-7 :转基因丹参株系1-7目的基 因的5'端序列；wt:野生型丹参植株阴性对照；B图中M:DNA分子量标准；P:表达载体目 的基因3'端序列的阳性克隆；1-7 :转基因丹参株系1-7目的基因的3'端序列；wt:野生型 丹参植株阴性对照。 阳03引图3为本发明实施例4中miR397a在转基因丹参叶中的表达；其中，横坐标1-7为miR397a转基因丹参的7个株系，wt为野生丹参；纵坐标为相对表达量。
[0036] 图4为本发明实施例5中丹参素、迷迭香酸、原儿茶醒、丹酪酸A和丹酪酸B对照 品的总离子流图；其中，横坐标为出峰时间，纵坐标为峰高。
[0037] 图5A-图