一种固相化细胞的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种固相化的细胞，及在生物工程领域的应用。
【背景技术】
[0002] 固相化细胞技术（ImmobilizedCells)是20世纪60年代发展起来的一口新兴 技术，在化工、能源、环保和医药等领域得到广泛的应用，它是指利用各种理化方法将游离 细胞定位于特定的空间区域内，提高细胞或酶的浓度，并保持生物活性和反复利用的技术。 与传统的悬浮生物处理法相比，固相化细胞有提高单位体积的细菌密度、菌体易回收、环境 耐受力增强等优点，而且将菌体固相化可增加底物或产品对细胞膜的渗透性和酶的热稳定 性。固相化细胞保持了胞内酶系的原始状态和天然环境，有效地利用游离细胞的完整酶系 和细胞膜的选择通透性，其优点体现于：1.不需要将酶从微生物细胞中提取出来并加W纯 化，酶活力损失小，成本低；2.酶处于天然细胞环境中中稳定性高；3.细胞生长停滞期时间 短，细胞多，反应快，抗污染能力强，可W连续发酵，反复使用，应用成本低。
[0003] 目前的细胞固相化技术最多采用的方法中，W海藻酸钢、角叉菜聚糖等为载体，水 溶解后通过和待固相化的细胞种子液混合，在含巧的溶液中形成凝胶，从而将细胞包埋或 者结合其中，形成包含有细胞的固相化颗粒。能够形成凝胶的材料分子还包括聚乙締醇。
[0004] 海藻酸钢是从褐藻中提取的多糖，主要成分是Beta-D甘露糖醒酸和A1地aA-古 洛糖醒酸构成的多糖。k古洛糖只在海洋植物中存在，动物体内不存在k古洛糖及其衍 生物，因此采用海藻酸钢包埋的细胞在动物体内生物相容性差，会引起免疫反应。而且海 藻酸可W吸附铜、锋和儘等二价金属离子，运些金属离子是动物细胞培养过程中需要添加 的微量元素，对于维持细胞的正常代谢和提高重组蛋白的表达水平有重要的作用。角叉菜 聚糖是从鹿角菜等海洋植物中提取的聚糖，又名卡拉胶。角叉菜聚糖需要在较高的溫度下 (80°C)才能溶于水，低溫下容易沉淀，而哺乳动物细胞一般不能耐受高溫。聚乙二醇也可 W用于细胞的包埋，但是易引起细胞脱水，在机体内有一定的毒性。
[0005] 果胶是食品的天然成分之一，天然果胶类物质W原果胶、果胶、果胶酸的形态广泛 存在于植物的果实、根、茎、叶中，是细胞壁的一种组成成分，它们伴随纤维素而存在，构成 相邻细胞中间层粘结物，使植物组织细胞紧紧黏结在一起。原果胶是不溶于水的物质，但可 在酸、碱、盐等化学试剂及酶的作用下，加水分解转变成水溶性果胶。果胶本质上是一种线 形的多糖聚合物，含有数百至约1000个脱水半乳糖醒酸残基，其相应的平均相对分子质量 为50000~150000。半乳糖及其衍生物是动物体内常见的糖分子，因此果胶在动物体内有 较好的生物相容性，安全性高，不会引起免疫反应。在细胞培养工程中也不会吸附微量元素 及其它的营养成分，对于维持哺乳动物细胞的正常代谢和高的重组蛋白表达水平具有重要 的意义。
[0006] 壳聚糖（化itosan)又称脱乙酷甲壳素，是由自然界广泛存在的几下质（化itin) 经过脱乙酷作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺（1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。自1859年， 法国人Rouget首先得到壳聚糖后，运种天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、 安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注，在医药、食品、化工、化妆品、生化 和生物医学工程等诸多领域的有了广泛的应用。同时，果胶和壳聚糖是联合国粮农组织和 世界卫生组织认定的食品添加剂，没有添加限制。
[0007] 由于果胶可W被人结肠中菌群分泌的果胶酶所降解，因此W果胶作为阴离子组 分、壳聚糖和巧离子作为阳离子组分，采用液中固相法制备骨架型微丸来制备药物结肠定 位释放制剂已经有广泛报道，但是没有报道用于活细胞的固相化。鉴于现有技术在细胞固 相化存在的上述技术问题，本发明意欲提供一种使用果胶对工程细胞进行固相化的方法， 从而有利于工程细胞的产物生成和应用。
【发明内容】
[0008] 基于上述发明目的，本发明首先提供了一种固相化细胞的制备方法，所述方法包 括W下步骤：
[000引 （1)在含欲被固相化细胞的悬液中加入果胶溶液，加入后的细胞悬液中，细胞浓度 为l04-l0Vml;果胶浓度为1-10%;
[0010] (2)在步骤（1)获得的细胞悬液中加入含有氯化巧和壳聚糖的溶液，揽拌5-15分 钟，其中氯化巧的浓度为0.5-10%，壳聚糖的浓度为0. 1-5% ;
[0011] 做过滤步骤似获得的溶液，并重新悬浮获得的细胞。
[0012] 在一个优选的技术方案中，所述步骤（1)中细胞浓度为5Xl〇5/ml，果胶浓度为 5%。
[0013] 在另一个优选的技术方案中，所述步骤（2)中氯化巧的浓度为3%，壳聚糖的浓度 为 0. 5%。
[0014] 在一个更为优选的技术方案中，所述细胞为可W表达并分泌抗人化r-2抗原人源 化单克隆抗体的工程细胞CH0。
[0015] 另一方面，本发明还提供了一种应用上述固相化细胞的制备方法表达并分泌抗人 Her-2抗原的人源化单克隆抗体的方法。
[0016] 在一个优选的技术方案中，所述方法包括：
[0017] (1)将上述步骤（3)制备好的CH0细胞微球悬浮于CD-Forti-CHO无血清培养基 中，振荡培养3-5天；
[0018] (2)回收培养基中的双特异性人源化单克隆抗体。
[0019] 在一个更为优选的技术方案中，所述细胞微球与所述培养基的体积比为1 :2，
[0020] 在一个最为优选的技术方案中，所述细胞的培养环境为37°C，5%的0)2,及15化pm 振荡培养。
[0021] 第=方面，本发明还提供了根据上述固相化细胞的制备方法获得的细胞在制备乳 腺癌治疗药物中的应用。
[0022] 在一个优选的技术方案中，所述细胞被制备为皮肤植入剂。
[0023] 发明人设计了采用果胶、壳聚糖和巧离子液相固化微丸的方法对工程细胞进行固 相化，从而可W保持细胞的活性。而果胶巧形成的骨架允许细胞的营养成分进入微丸，维持 细胞的正常生长和分裂，细胞的代谢产物可W分泌出微丸，进而从培养基中分离纯化相关 的重组蛋白；采用果胶巧包埋的能够表达并分泌双特异性人源化单克隆抗体的CK)工程细 胞，可w连续培养进行抗体的生产；包埋后的细胞抗体分泌量在第一次培养阶段，抗体的表 达量略低于常规培养的CK)细胞，在第二和第=批次3-5天的抗体表达量，可W达到常规培 养14天的表达量。抗体的生产时间可W缩短到3-5天，与常规的培养20-30天的时间相 比，大大提高了生产效率；而且，细胞微球的培养基中CK)细胞残留蛋白的浓度显著低于正 常培养的CHO细胞，第一批次HCP的浓度为37. 5yg/ml，第二批次的HCP浓度为43. 4yg/ ml,第S批次的HCP浓度为52. 7yg/ml，而常规培养的CHO细胞培养基中HCP的浓度达到 162. 6yg/ml，说明包埋后细胞的存活率较高，HCP的浓度较低，在后续的抗体纯化中，可W 显著降低HCP的残留。而死亡细胞的DNA与果胶巧结合，不全部释放到培养基中，测定的 CH0DNA浓度只有常规培养细胞的1/10,因此可W显著提高后续纯化过程抗体的纯度，降低 杂质的含量。
[0024] 固相化的细胞可W作为植入剂植入病人皮下，分泌的治疗性蛋白，如抗体类药物、 EP0等可W直接进入人体，起到治疗疾病的作用。在一定时间，可W将微丸通过手术的方法 取出并放置新的微丸，避免了长期注射的问题。而且，果胶巧微丸具有良好的生物相容性， 未在移植部位产生明显的排斥反应，稳定性也较好，17天未见微丸明显的降解和破坏，因此 运一方法也可W用于疾病的治疗。
【附图说明】
[00巧]图1.常规培养细胞与被包埋后的细胞分泌抗体浓度的柱状图；
[0026] 图2.培养基中CH0细胞蛋白残留浓度的柱状图；
[0027] 图3.被包埋细胞微丸的小鼠观察图；
[002引图4.被包埋小鼠血清中双特异性抗体的浓度随时间变化的曲线图。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但运些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
[0030] 实施例1.固相化细胞微丸的制备
[0031] 细胞的培养：可W表达抗人化r-2抗原的人源化单克隆抗体化rc巧tin的 C册细胞（构建方法见中国专利申请CN201510368641. 7)接种于CD-Forti-C册培养基 (Invitrogen，货号：A11483-〇l)，37°C，5%C〇2,ISO巧m振荡培养至细胞密度达到 5X1〇6/ ml, 100化pm室溫离屯、5分钟，弃上清，用新鲜的培养基垂悬细胞，调整细胞密度到lOVml， 备用。
[0032] 氯化巧交联溶液的配制：氯化巧3 % (g/v，浓度范围：0. 5-10 % )，0. 5 % (0. 1-5% )壳聚糖，溶解于80mlCD-Forti-C册培养基中，采用1%的憐酸调节抑值到 5. 5 (2. 5-7. 0)，至溶液完全变清，补充体积到100ml，0. 22um滤器过滤除菌。
[0033] 果胶巧微丸的制备步骤：
[0034] (1)含果胶细胞悬液的配制：
[00对 果胶5g溶解于90mlCD-Forti-C册培养基（Invitrogen)，4°C揽拌过夜，0. 22um 过滤除菌，溫度恢复到室溫后，加5ml细胞悬液，补充体积到100ml，此时细胞密度5X10^ ml(范围：l04-l0Vml)，果胶浓度为5%(浓度范围：0. 5-10%)。
[003引似交联
[0037] 在生物安全柜中采用注射器巧血，7#针头）将果胶细胞悬液边缓慢揽拌边滴加 到抑5. 5氯化巧交联溶液中，针头离液面高度约为5cm左右，用磁力揽拌器揽拌，滴速大约 2血/min,交联时间lOmin。交联完成后，筛网过滤，PBS清洗S次，重悬于CD-Forti-C册培 养基中进行培养。
[003引所制备的微丸均为圆球形，用光学显微镜进行目测法测定微丸的直径。具体操作 为：取少许湿微丸，加蒸馈水分散，盖上盖玻片（注意除尽气泡），用有刻度标尺（刻度已校 正其每格的ym数）的接目镜的显微镜，测量100个微囊，微丸粒径分布在0.8-1. 1mm间， 微丸外膜的厚度大约为0. 05-0. 07mm。
[0039] 实施例2.固相化细胞的流