Deae-琼脂凝胶微球及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及凝胶微球，尤其是设及DEAE-琼脂凝胶微球及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 藻红蛋白任hycoe巧t虹in,阳）、藻蓝蛋白（Phyco巧anin，PC)是多亚基超大分子 量的蛋白色素复合物，与别藻蓝蛋白（Allophycocyanin，APC) -起构成棒状的藻胆体，附 着在类囊体膜的外表面上，构成藻类的捕光系统；除了在光合作用中捕获光量子、传递能量 夕F，还作为储存的蛋白能够使藻类在氮源缺乏的季节维持生存。藻红蛋白根据来源和光谱 特性的不同可分为R-藻蓝蛋白、B-藻红蛋白和C-藻红蛋白，藻蓝蛋白则有R-藻蓝蛋白和 C-藻蓝蛋白两种。
[0003] 藻红蛋白和藻蓝蛋白作为水溶性的大分子量功能蛋白，用途极为广泛，可应用于 医学诊断、肿瘤光动力治疗、食品和化妆品的添加剂等。藻红蛋白、藻蓝蛋白的光吸收系数 大、巧光量子产率高、斯托克位移大、背景光干扰小、不易泽灭、稳定性强，可与特异的抗体 或其它的生物分子发生结合，故常作为巧光试剂应用于医学诊断、免疫化学和生物工程等 研究领域（流式细胞仪、巧光活细胞分选、巧光免疫分析等）；藻红蛋白、藻蓝蛋白作为肿 瘤光动力治疗的最具有开发潜力的光敏剂，可在病灶部位富集，吸收光后高效产生自由基 和活泼态氧，从而实现对肿瘤细胞的杀伤，有光毒性而没有暗毒性，在人体内代谢快，具有 高效、无毒、副作用小等优点（要用作分子探针和光敏剂的藻红蛋白、藻蓝蛋白，纯度分别 要求A565/A280M. 0、A620/A280M. 0,即试剂级纯度）；藻红蛋白、藻蓝蛋白还具有一系列 重要的生理活性，如抗氧化、抗病毒、抗炎症、抗福射、提高人体免疫力等，可制成保健食品 和药品用于保健、医疗上；食品级藻红蛋白可W取代人工合成色素，用作普通食品和化妆品 的添加剂，不仅可W避免人工色素对人体可能的副作用，而且可W使食品色彩艳丽、使化妆 品的美容修饰和养颜护肤效果增强。目前我国生产的藻红蛋白多为食品级。高纯度的藻 红蛋白生产技术基本由Sigma公司垄断，价格十分昂贵：货号为P8912的R-藻红蛋白标准 品价格为6961. 50元/mg，货号为52412的试剂级纯度（A566/A280M. 6)R-藻红蛋白价格 为 1572. 48 元 /mg，货号 52468 的C-藻蓝蛋白（A620/A280〉3. 5，A651/A620<0. 3)价格为 1590. 03元/mg(Sigma公司2015年产品目录）。
[0004] 高纯度藻红蛋白、藻蓝蛋白的制备，是将原料进行细胞破碎、盐析、冷冻离屯、、透析 或超滤等预处理之后，再通过径基憐灰石柱层析结合离子交换层析进行纯化。所用的离子 交换层析填料最常见的是进口的DEAE-Se地arose, Sigma公司给出的报价是1856. 79元 /50血；使用 GE 公司的 DEAE-Se地aroseFF、Se地adexG-150、Se地ac巧 1 S-200皿等凝胶 介质，价格同样十分昂贵，只适合用于实验室研究。因此，制备出高效、经济、易于放大的柱 层析介质对于规模化生产高纯度的藻红蛋白来说是首要的任务。
[0005] 目前的国内外文献中应用离子交换层析介质分离藻红蛋白的纯度多在A565/A280 =5. 0左右，澡蓝蛋白多为A620/A280 = 4. 5左右。郑尉然（郑尉然.坛紫菜R-澡红蛋白 的分离纯化及其稳定性研究巧].浙江工业大学.2008)通过HA柱和DEAE-Se地aroseF.F 离子交换柱层析得到纯度5. 3的坛紫菜R-PE ;S. N. Tripathi等人仅N. Tripathi，Shivali Kapoor,Alpana Shrivastava. Extraction and purification of an unusual phcoerythrin in 曰 terrestri曰1 desicc曰tion toler曰nt cy曰nob曰cterium Lyngby曰 arboricola[J]. J Appl Phycol, 2007, 19:441-447)应用S巧hac巧1 S300皿凝胶层析 和DEAE-cellulose可得到纯度5. 24的藻红蛋白；Jian等人（Jian-Feng Niu, Zhang-Fan Chen,Guang-Ce Wang,etc.Purification of phycoerythrin from Porphyra yezoensis Ueda(Bangiales, Rhodophyta)using expanded bed absorption[J].J Appl Phycol, 2010, 22:25-31)利用Pheny；L-Se地arose和DEAE-Se地arose可从条斑紫菜中提 取出纯度4. 5的R-PE Caroline等人（Caroline Costa Moraes, Susana Juliano Kalil. Strategy for 曰 protein purification design using C-phycocy曰nin extr曰ct[J]. Bioresource Technology, 2009, (100) :5312-5317)使用强阴离子交换介质Q Se地arose和 分子排阻凝胶Se地acyrl S-100皿从螺旋藻中提取纯度4. 0的C-PC ;廖晓霞等人（廖晓霞， 张学武.高效分离纯化藻蓝蛋白新法[J].食品工业科技，2011,32化）：273-275)先用壳聚 糖和活性炭处理藻胆蛋白粗品，再用DEAE-SephadexA-25凝胶层析，可得纯度4. 3的藻蓝蛋 白。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供DEAE-琼脂凝胶微球及其制备方法。
[0007] 本发明的另一目的是提供DEAE-琼脂凝胶微球在分离高纯度紫菜R-藻红蛋白和 螺旋藻C-藻蓝蛋白中的应用。
[0008] 所述DEAE-琼脂凝胶微球的化学结构式为：
[0009]
[0010] 其中，M代表琼脂糖或者硫琼胶；DEAE中的面代C1原子W离子的形式结合在氨基 上。
[0011] 所述DEAE-琼脂凝胶微球的制备方法，包括W下步骤：
[0012] 1)将琼脂粉加入=口烧瓶，再加入水，加热溶解，得琼脂溶液；另在反应蓋中加入 环己烧和司班85,将琼脂溶液倒入反应蓋，在70°C下揽拌，冷却后取出混合液，放置直到微 球沉降，再洗涂，得琼脂凝胶裸球；
[0013] 2)在S口瓶中加入步骤1)得到的琼脂凝胶裸球和水，加热揽拌下加入环氧氯丙 烧，待溶解后，加入化0H溶液，将水浴溫度升至60°C，持续揽拌，冷却至室溫后加入水，调抑 至5~6,再用水和乙醇交替洗净后，所得的琼脂凝胶微球保存在乙醇中；
[0014]如将步骤。所得琼脂凝胶微球移入烧瓶中，加入DEAE-肥1，另将化0H溶液置于 烧杯中，密封后预热，再将预热后的烧杯中的化0H倒入烧瓶中，封口，开动旋转蒸发仪，反 应化W上，再取出烧瓶，用水冷却，得琼脂微球；
[0015] 4)将步骤3)得到的琼脂微球洗涂，即得到DEAE-琼脂凝胶微球。
[0016] 在步骤1)中，所述琼脂粉与水的配比可为90g: 1500血；所述加热的溫度可为 100°c;所述环己烧和司班85的体积比可为2.8: 0. 75,所述揽拌的条件可在4(K)r/min下 揽拌40min后；所述洗涂可采用质量百分浓度为20%的酒精洗涂。
[0017] 在步骤2)中，所述琼脂凝胶裸球、水、环氧氯丙烷的配比可为25g: 35血：2血， 所述水可采用去离子水；所述加热揽拌的条件可在35°C，200r/min条件下揽拌；所述化0H 溶液的加入量按质量百分比可为环氧氯丙烷的4 0 %，所述加入化0H溶液的流速可为 0. 2mL/min;所述持续揽拌的时间可为化；所述调抑至5~6可采用质量百分浓度为60% 的醋酸调抑至5~6;所述再用水和乙醇交替洗净的乙醇可采用质量百分浓度为50%的乙 醇；所述琼脂凝胶微球保存在乙醇中的乙醇可采用质量百分浓度为20%的乙醇.
[0018] 在步骤3)中，所述DEAE-肥1、化0H溶液、琼脂凝胶微球的体积比可为8:8: 5， 所述DEAE-肥1的摩尔浓度可为1. 0~4. 0mol/l，^0H溶液的摩尔浓度可为1. 0~4.Omol/ L;所述预热可采用在水浴锅中预热，预热的溫度可为40~80°C，预热的时间可为lOmin。
[0019] 在