快速检测家蚕微孢子虫的引物对及其试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和免疫学领域，快速检测家蚕微抱子虫的引物对，还设及 快速检测家蚕微抱子虫的引物对试剂盒和利用该试剂盒检测家蚕微抱子虫的检测方法。
【背景技术】
[0002] 为有效控制蚕业生产中因家蚕微抱子虫引发的家蚕微粒子病，W免其引发家蚕 大量死亡，需要开发灵敏、便捷、准确的家蚕微抱子虫检测方法。家蚕微抱子虫（Nosema bombycis)，也称家蚕微粒子虫，主要寄生于经济昆虫家蚕体内，所引发的家蚕微粒子病是 蚕桑产业上毁灭性的病害，其病原家蚕微抱子虫被世界各养蚕国家和地区列为蚕业生产上 的法定检疫对象，而在成品卵时期成功检出家蚕微抱子虫对于蚕业生产中的家蚕微抱子虫 防控具有重要作用。
[0003] 在传统的蚕业生产中，为了生产无毒蚕卵控制家蚕微抱子虫的传播，蚕种检疫部 口常采用的是母蛾镜检法，是一种间接判定法，其主要过程为：研磨母蛾后，通过光学显微 镜镜检的方法进行家蚕微抱子虫的检测，将有毒母蛾所产的卵视为有毒卵，从而间接判定 成品卵中是否含有家蚕微抱子虫，整个检验过程耗费人工，且最终检测结果对镜检人员的 经验要求较高，主观性强；另一方面，蚕种场送检的母蛾未必能够代表整批成品卵产品的真 实情况。基于W上原因，一种能够直接检测成品卵中的家蚕微抱子虫的检测方法急需建立。 基于核酸扩增方法的检测对象是来自家蚕微抱子虫的DNA，经特异性扩增后进行产物鉴定， 运类方法灵敏度高，特异性好。
[0004] 虽然核酸扩增检测法具有灵敏度高、特异性和可靠性强，但运一类方法通常设备 依赖性较强，而且扩增结果需用琼脂糖凝胶电泳并进行图像采集后才能获得最终检测结 果，耗时较长。
[0005] 另一种检测方法基于双抗夹屯、的免疫学检测方法，其检测对象主要是病原蛋白 质，检测结果的特异性由特异性针对该蛋白质的抗体保证，是一种快速检测的常规方法，运 种方法能够与胶体金试纸条检测技术相结合，具有成本低廉、操作简单的优点。在免疫胶体 金试纸条检测中，常利用抗原-抗体特异性结合的特点，构建抗原-抗体-胶体金颗粒的复 合体，当该复合体集中在试纸条的检测线上时，胶体金颗粒能够形成红色沉淀线，但该种方 法的灵敏度依赖于高亲和力W及高特异性抗体的获得W及样品中的抗原含量，家蚕成品卵 中的微抱子虫数量极少，其对应的抗原量也相应很少，也限制该方法在成品卵检疫中的应 用。
[0006] 综上所述，如果能在核酸扩增产物中加入特殊的标记物，就能使得PCR扩增的产 物也能够用免疫胶体金试纸条检测，可W减少对仪器依赖，并加快检出时间。因此在本检测 方法的PCR过程中使用了 一对同时标记了两种化合物的引物，该试纸条是W双抗（或配体） 夹屯、法的方式检测。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种快速检测家蚕微抱子虫的引物对，特 异性好；本发明的目的之二在于提供快速检测家蚕微抱子虫的引物对试剂盒，特异性好，灵 敏度高，本发明的目的之=在于提供利用快速检测家蚕微抱子虫的引物对试剂盒检测家蚕 成品卵中家蚕微抱子虫的检测方法，操作步骤简便。
[000引为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0009] 1、快速检测家蚕微抱子虫的引物对，所述引物对的核巧酸序列如SEQIDNO. 7和 SEQIDNO. 8所示。该引物对选择区域合适，避免了引物二聚体的形成，从而杜绝了假阳性 的产生。
[0010] 2、快速检测家蚕微抱子虫的试剂盒，所述试剂盒包括两种不同核酸分子标记物， 分别标记SEQIDNO. 7和SEQIDNO. 8的引物对和胶体金免疫层析试纸条，所述胶体金免 疫层析试纸条的点样区喷涂有连接其中一种核酸分子标记物抗体的胶体金颗粒，检测线固 定有与另一种核酸分子标记物特异结合的配体。由于引物中引入了特殊的标记物，使得PCR 扩增的产物能够用免疫胶体金试纸条检测，简化了检测步骤，并且本发明使用的引物对特 异性好，灵敏度高，与传统的凝胶电泳相比，其敏感度增加10倍。
[0011] 作为本发明优选的技术方案，所述核酸分子标记物为生物素、地高辛、簇基巧光素 或异硫氯酸巧光素。运几种标记物可W被其对应的抗体或配体特异性识别，且特异性高，从 而通过免疫学的方法进行检测。
[0012] 作为本发明更优选的技术方案，所述核酸分子标记物为生物素或簇基巧光素，配 体为链霉亲和素分子和抗簇基巧光素兔抗。
[0013] 本发明试剂盒中还包括展开液，所述展开液各组分浓度如下：TrisIOmM,BSA 1%，NaC1137mM，KCl2. 7mM，NazHPOJOmM和KH2P〇42mM。展开液中的Tris成分能在一定程 度上实现对引物二聚体及非特异性扩增产物的清除。
[0014] 本发明中，所述试剂盒还包括待检样品处理液和裂解液，所述待检样品处理液为 质量分数为4%的KOH;所述裂解液含体积分数为1 %的NP-40 (乙基苯基聚乙二醇）和体 积分数为2%的化itonX-IOO(聚乙二醇辛基苯基酸）。待检样品处理液能够使家蚕微抱 子虫表面部分蛋白脱落，裂解液主要目的是裂解家蚕微抱子虫释放出DNA，W作为PCR扩增 反应的模板。
[0015] 由于本发明DNA提取中并未对所提取的家蚕微抱子虫基因组DNA进行纯化，因此 会有较多杂质，其普通的PCR核酸聚合酶并不适用于该检测体系；选用热启动的PCR核酸聚 合酶能够有效降低PCR过程中的引物二聚体和非特异性扩增产物的生成，所W在本发明中 使用了适用于模板来源复杂的热启动PCR聚合酶Mi曲tyAmpDNApolymeraseVer. 3。
[0016] 作为本发明进一步优选的技术方案，利用待检样品处理液和裂解液提取DNA的步 骤如下：取蚕卵加水研磨后离屯、，收集沉淀，在沉淀中加入待检样品处理液，混匀18~25°C 放置IOmin后用水清洗，离屯、收集沉淀，然后向沉淀中加入裂解液，100°C放置1虹。
[0017] 作为本发明最优选的技术方案，所述胶体金免疫层析试纸条由W下方法制备：先 用抗簇基巧光素兔抗（抗FAM兔抗）与胶体金颗粒交联，形成胶体金-抗簇基巧光素兔抗 复合物，然后喷涂于点样区；再用生物素的配体链霉亲和素在纤维膜上按线状喷涂，形成检 测线；最后与吸水滤纸、样品垫和底板组装胶体金免疫层析试纸条。为了证明试纸条处于有 效期内在检测线下游固定质控线，质控线上包被抗兔IgG的二抗，如羊抗兔IgG抗体。
[0018] 3、利用所述快速检测家蚕微抱子虫的试剂盒检测家蚕微抱子虫的方法，包括如下 步骤：
[0019] A.提取待测样品DNA，然后W核酸分子标记物分别标记SEQIDNO. 7和SEQID NO. 8的引物对进行PCR扩增，收集扩增产物；
[0020] B.将步骤A)所得扩增产物点于所述胶体金免疫层析试纸条的样品垫，并用含核 酸变性剂的展开液层析，根据检测线是否有可见条带，判定阴性或阳性；如果有可见条带， 判定为阳性，如果无可见条带，判定为阴性。
[0021] 检测原理如下：当存在待检的特异性扩增产物时，扩增产物带有不同的标记物，形 成标记A-扩增产物-标记B复合物，标记A-扩增产物-标记B复合物与胶体金-抗标记 A抗体复合物结合，形成胶体金颗粒-抗标记A抗体-标记A-扩增产物-标记B的红色颗 粒复合物，红色颗粒复合物在展开缓冲液中沿试纸条方向层析，在检测线部位与标记B的 配体结合，形成肉眼可见的红色线条，判定为阳性；当特异性扩增产物不存在时，不能形成 胶体金颗粒-抗标记A抗体-标志物A-扩增产物-标记B的红色颗粒复合物，检测线上不 能与标记B的配体结合，不能形成红色线条，判定为阴性。 阳02引本发明步骤A中，所述PCR扩增条件为98°C预变性5min，98°C变性10sec，64°C退 火15sec，68°C延伸35sec，扩增30个循环；最后68°C延伸3min。
[0023] 本发明说明书中所使用的技术术语解释：
[0024] PCR:聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)的简称，可W放大扩增特定 DNA片段的分子生物学技术。
[00巧]引物：引导DNA合成酶进行DNA合成的物质，一般为一对单链寡核巧酸，与扩增模 板相结合后，从引物的3'端开始合成。
[00%] 标记：将能被检测到的分子与单链寡核巧酸偶联在一起的方法。
[0027] 抗体：能与抗原或半抗原特异性结合的蛋白质分子。
[0028] 引物二聚体：在PCR过程中，在上下引物间，或单向引物自身之间的连接现象称为 引物二聚体，单向引物自身之间形成的引物二聚体不会形成假阳性信号。
[0029] 核酸聚合酶：催化合成核巧酸链的酶类，主要分为DNA聚合酶和RNA聚合酶。
[0030] 本发明的有益效果在于：本发明是W标记的特异性引物对扩增合适的基因片段， 能保证扩增结果的特异性，从而保证了检测结果的准确性；为了简化检测程序将设计的特 异引物进行双标记，从而避免了外加带标记的探针的繁杂过程；扩增产物直接使用免疫胶 体金试纸条判定，使得整个检测过程在保持检测结果准确性的基础上简化了操作步骤，整 个检测过程方便快速；本发明还提供了一种的家蚕成品卵中家蚕微抱子虫核酸扩增检测的 样品处理方法，该方法与传统提取家蚕微抱子虫基因组的方法相比，快速、高效。因此本发 明是一种理想的家蚕成品卵中家蚕微抱子虫的检测手段。
[0031] 本专利还提供快速检测家蚕成品卵中家蚕微抱子虫的试剂盒，具有如下优点： 阳〇巧操作简单：全部检测过程仅需将扩增产物加在展开缓冲液里后，将混合物滴加在 试纸条上即可，无需专业人员操作，适用于蚕种场用工环境；
[0033] 快速：扩增产物滴加到试纸条2-5min后即可判定结果；
[0034] 灵敏度：比琼脂糖凝胶电泳灵敏10倍，可检出光学显微镜中无法检出的家蚕微抱 子虫；
[0035] 特异性高：因为使用了标记的特异性引物对，其检测结果更加准确客观。
【附图说明】
[0036] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0037] 图 1 为引物筛选结果图（A:LSU149;B:LSU151;C:LSU153;D:LSU323;E:LSU3238 和LSU397;F:LSU480;G:LSU482 ;图中Nb:家蚕微抱子虫；Ser:沙雷氏菌；BmNPV:家蚕核型 多角体病毒；Bp:球抱白僵菌；S.au:金黄色葡萄球菌）。
[0038] 图2为采用特异性标记引物LSU480检测球抱白僵菌胶体金免疫层析试纸条结果。
[0039] 图3为采用特异性标记引物检测家蚕微抱子虫特异性检测结果（A:琼脂糖凝胶电 泳；B:胶体金免疫层析试纸条）。
[0040] 图4为采用特异性标记引物检测家蚕微抱