一种检测jak2基因突变的引物与方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，尤其设及一种检测JAK2基因突变的引物与方法。
【背景技术】
[0002] JAK/STAT通路是造血生长因子广泛应用的信号传导通路，该通路的激活与多种肿 瘤相关。JAK2基因编码Janus酪氨酸激酶2(Januskinase2,JAK2)，参与造血细胞的增 殖、分化、调亡W及免疫调节等多种反应。
[0003] 骨髓增殖性疾病（Myeloproliferativeneoplasms,MPN)是一系或多系分化相对 成熟的骨髓细胞不断克隆性增殖所致的一组肿瘤性疾病的统称，其中W真性红细胞增多症 (PV)、原发性血小板增多症巧T)、骨髓纤维化（M巧最常见。MPN发病机制不明，但大部分患 者存在JAK2基因突变的情况，其中，JAK2的14号外显子V617F突变是最为常见的突变，见 于约95%的PV、约50%的ET和MF患者中。2007年Scott等首次报道JAK2V617F阴性的 PV患者中存在JAK2基因12外显子的突变，相关研究数据显示，JAK2基因外显子12和13 主要影响红系发育，约2%-4%的PV患者JAK2基因外显子12、13发生突变，但未发现JAK2 基因外显子12、13突变与ETW及MF等JAK2V617F阴性的其它MPN的相关性。
[0004] 和JAK2V617F单一位点突变不同，JAK2基因外显子12的突变形式多样，设及所 编码蛋白的第536至547位氨基酸，突变类型包括点突变、缺失及插入，JAK2基因外显子13 突变形式则主要为点突变（COSMIC)。
[0005] 中国专利申请201110396831. 1公开了检测JAK2基因突变的引物和探针，该专利 申请将特异性引物与双环探针相结合，通过巧光PCR实现了JAK2基因突变的检测，但存在 反应体系复杂，需要多种引物和巧光定量PCR仪的缺点。
【发明内容】
[0006] 为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种检测JAK2基因突变的引物与方 法，该引物具有特异性好、灵敏度高等优点，实现了检测JAK2基因外显子12和外显子13突 变的准确检测。本发明检测的位点包括JAK2基因外显子12和外显子13。 阳007] 本发明提供一种检测JAK2基因突变的引物，包括针对JAK2基因外显子12的上游 引物TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTTTGGAGCAATTCATAC(沈QIDNO. 1)和下游引物CAGGAAACAG CTATGACCCATCTAACACAAGGTTGGCATA(SEQIDNO. 2)，W及针对JAK2 基因外显子 13 的上游引 物TGTAAAACGACGGCCAGTTTTCTGTCTCTTATTACTATTTA(SEQIDNO. 3)和下游引物CAGGAAACAG CTATGACCTCCTCAGAAAAGTCCTTGACACATT(SEQIDNO. 4)〇
[0008] 优选地，所述引物中，外显子12的上游引物、外显子12的下游引物、外显子13的 上游引物和外显子13的下游引物浓度比为1 :1 :1 :1。
[0009] 相应地，本发明还提供一种检测JAK2基因突变的方法，包括如下步骤：A)提取DNA 样品；B)采用权利要求1或2中所述的引物进行PCR扩增；C)对扩增产物进行凝胶电泳分 析后，采用Sanger测序法检测，对检测结果进行分析。
[0010] 优选地，所述步骤A)中的DNA样品为邸TA抗凝外周血或骨髓血的DNA样品。
[0011] 优选地，所述步骤B)中的PCR扩增反应条件包括：阶段1 :98°CSmin;阶段2 :98°C 1〇3;阶段3:631：3〇3;阶段4:72°(：1111111;阶段5:返回到阶段2,29个循环；阶段6:721： Smin;阶段7 :25 °C保溫。
[0012] 优选地，所述步骤C)中，采用Sequencher4. 1. 4软件对检测结果进行分析。
[0013] 此外，本发明还提供检测JAK2基因突变的引物在制备检测JAK2基因突变试剂中 的用途。
[0014]与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种检测JAK2基因外显子 12和外显子13突变的引物，该引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。此外，本发明 还提供了一种检测JAK2基因外显子12和外显子13突变的方法，通过使用特异性的引物， 具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，可W作为JAK2 V617F检测阴性的真性红细胞增 多症患者的辅助检测方法，进而为其临床用药提供指导。
【附图说明】
[0015] 图1本发明提供的JAK2基因外显子12引物的扩增片段。
[0016] 图2本发明提供的JAK2基因外显子13引物的扩增片段。
[0017] 图3 PCR扩增产物的凝胶电泳图。
[0018] 图4 JAK2基因外显子12野生型的部分测序图。
[0019] 图5 JAK2基因外显子13野生型的部分测序图。
[0020] 图6JAK2基因外显子12突变型的部分测序图。
[0021] 图7 JAK2基因外显子13突变型的部分测序图。 阳02引图8同一样品不同批次的PCR扩增产物的部分凝胶电泳图。
[002引图9同一样品不同孔间的PCR扩增产物的部分凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。 阳〇2引实施例一引物 发明人针对JAK2基因外显子12和外显子13,设计了大量引物，通过引物反应条件的优 化和比较，筛选出了特异性好的引物。
[0026]
实施例二引物的特异性 将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting, JAK2基因外显子12引物扩增片段位 于C虹9:5069859-5070214间，长度为356bp;JAK2基因外显子13引物对扩增片段位于C虹9:5072300-5072758,长度为459bp。无其它同源基因，结果如图1至图2所示，与JAK2 基因参考序列相符。
[0027]使用表1中的引物、表2中的PCR扩增体系和表3的PCR扩增条件对检测样品进 行扩增，对扩增产物进行凝胶电泳分析，结果如图3所示。结果显示，扩增产物的特异性高， 无非特异性扩增条带产生。
[002引实施例SJAK2基因外显子12和外显子13突变的检测 提取邸TA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANamp Blood DNA Kit(购自Tiagen,货号：DP318)的说明书，将DNA样品稀释至l(K)ng/iiL备用。
[0029] PCR扩增采用Q5?热启动超保真2X Master Mix(购自肥B公司，货号：M049化）， PCR扩增体系如表2所示，PCR扩增条件如表3所示。外显子12的上游引物、外显子12的 下游引物、外显子13的上游引物和外显子13的下游引物浓度比为1 :1 :1 :1，外显子12的 上游引物浓度、外显子12的下游引物浓度、外显子13的上游引物浓度和外显子13的下游 引物浓度都为lOp/mol。
[0030]
对PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，结果如图3所示。结果显示，扩增产物的特异性高， 无非特异性扩增条带产生。