一种通过降低副产物乙酸高效生产1,3-丙二醇的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体地说，即：同时敲除克雷伯氏肺炎杆菌中与乙 酸合成相关的两个基因，从而提高1，3 -丙二醇发酵的生产水平。
【背景技术】 阳00引 1，3 -丙二醇（1，3 -po;rpanediol，简称1，3 -PD)是一种重要的化工原料，其最 重要的用途是作为单体合成新型聚醋一一聚对苯二甲酸丙二醇醋（PTT)。研究表明PTT- 种性能特别优异的聚醋材料，因而1，3 -PD的工业价值日益引起各国的重视。现在的研究 表明：1，3 -PD的生产方法中生物合法法因条件溫和、操作简单、副产物少、绿色环保，比化 学合成法更有工业应用的优势。特别是随着生物柴油工业的发展，产生了大量廉价的工业 甘油原料，利用廉价的工业甘油原料生物合成法生产1，3 -PD成为现今1，3 -PD生产研 究中的一个热点。
[0003] 自然界中能将甘油转化为1，3 -PD的微生物大致包括：克雷伯氏肺炎杆菌 (Klebsielapneumoniae)、弗氏巧樣菌（Citrobacterfreundii)、下酸梭状芽抱杆菌 (Clostridiabutyricum)等等。其中克雷伯氏肺炎杆菌因生物转化效率高、生物转化过程 操作方便，研究应用最多。但是克雷伯氏肺炎杆菌利用甘油生产1，3-ro的同时还会产生大 量的副产物，主要有乳酸、2, 3-下二醇和乙酸等，其中副产物乙酸的毒性最强。
[0004] 本发明公开了一种通过降低克雷伯氏肺炎杆菌的乙酸合成，提高产物1，3-ro生 物合成的方法。该方法通过同时敲除克雷伯氏菌中与乙酸合成关联的两个基因poxB和 pta，W降低克雷伯氏菌中副产物乙酸的合成，提高产物1，3-ro的产量。poxB基因负责编码 丙酬酸氧化酶，在生物体内催化丙酬酸合成乙酸；Pta基因负责编码憐酸转乙酷酶，该酶是 催化乙酷辅酶A合成乙酸中的关键酶，目前有关运两个基因在克雷伯氏菌中的具体作用还 没有详细研究，通过同时敲除运两个基因提高1，3-ro的产量的研究更是没有报道。经过检 索国家知识产权局（WWW.Sipo.gov.cn)、世界产权组织（WWW.Wipo.int)、欧洲专利局Grow. espacenet.com)和美国专利商标局（WWW.uspto.gov)也没有发现与本专利保护请求相同 的公开专利或授权专利。
【发明内容】
阳0化]本申请的发明人在研究中发现，同时敲除克雷伯氏菌中两个基因poxB、和Pta可W显著降至乙酸的合成，并能显著提高1，3-PD的生物合成。所W，本发明目的在于提供一 种更高效生产1，3 -PD的方法，即：将克雷伯氏肺炎杆菌中两个基因poxB和Pta同时敲除， 高效地生产1，3 -PD。与现有的技术相比，利用本发明生产1，3 -PD时，产生更少的副产 物乙酸，极大缓降了后期乙酸积累对发酵的影响，提高了 1，3-PD的生产速度，同时因更多 的甘油转变为1，3 -PD也大大提高了 1，3 -PD生物合成的转化率。
[0006] 本发明是通过W下技术方案实现的：将克雷伯氏菌中的两个基因poxB和Pta同时 敲除，高效生产1，3 -PD。本发明包括种子培养W及发酵罐发酵转化甘油生成1，3 -PD。
[0007] 根据本发明，所述poxB和Pta两个基因具体如下：
[0008] DpoxB:负责编码丙酬酸氧化酶巧C1. 2. 5. 1)，该酶又称丙酬酸脱氨酶；
[0009] 2)Pta:负责编码憐酸转乙酷酶巧C2. 3. 1.8)。
[0010] 根据本发明，用于转化甘油生成1，3 -PD的菌株为克雷伯氏肺炎杆菌 化.pneumoniae)。相比现有的转化甘油生产1，3 -PD的方法，本发明的方法的优点是：畐山 产物少，产物合成速度快、转化率高。
【具体实施方式】
[0011] W下结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。应理解，W下实施例仅用于说 明本发明，而非用于限定本发明的范围。
[0012] 实例中，斜面培养基的配方如下：
[0013] K2HPO43H2O7g/l，（NH4)2S04Ig/LKH2PO42g/l，MgClzTHzOO. 1g/l，酵母膏 7邑/1，微 量元素各0. 3血，调整抑7. 0,琼脂2g/L。
[0014] 种子培养基的配方如下：
[0015] K2HPO43H2O7g/l，（畑4)25〇4Ig/l，KH2PO42g/l，MgCl27H2〇0.Ig/l，酵母膏 7邑/1，微 量元素各0. 3血，调整抑7.0后加入化Cl调节渗透压。
[0016] 发酵罐培养基的配方如下：
[0017] KCl0. 75g/l，NaHzPO* 1. 38g/l，（畑4)25〇4 5. 35g/l，Na2S〇40. 28g/l，1拆〇46&0 0. 26g/l，巧樣酸0. 42g/l，酵母粉2g/l，微量元素各0. 3mU调整pH7. 0。
[0018] 微量元素的配方如下：
[0019] ZnClz：M. 2g/L，2. 7g/L，MnClzAHzOlOg/L，C11CI22H200 . 85g/L，C0CI22H2O 23.8g/l，H3BO30. 31g/l，Na2Mo〇4 0. 25g/L
[0020] 实施例中，测定发酵液中菌体干重的方法如下：
[OOW 取1. 0血发酵液稀释7 - 10倍，W去离子水为对照，在721分光光度计上于620皿 读取0D。取不同菌浓（即不同620nm吸光值）的菌液IOmU经离屯、收集菌体，并用去离子 水洗涂二遍洗涂，将再次离屯、收集后的菌体于8(TC烘箱中干燥至恒重。称量菌体作出菌体 干重与0成2。的标准曲线，并回归出关系式。W后菌体的干重根据测定的菌液的OD62。值由 标准曲线回归关系式计算得出。发酵液中1，3 -PD的测定采用气相色谱法；乙酸的测定 采用液相色谱法。产1，3 -PD的菌株采用克雷伯氏肺炎杆菌CCTCCM2014574,W下简称 M2014574。
[0022] 实施例1、单独敲除poxB基因严重降低菌体生长，不利于1，3 -PD的合成
[0023] 将12014574菌株于18培养基（0.5%酵母提取物，1%膜蛋白腺，1%化(：1，9^.0) 中37°C培养过夜，抽提基因组。W抽提好的M2014574基因组为模板，依据NCBI登录的克 雷伯氏肺炎杆菌MGH78578的基因组序列ODCUS:NC_ 009648)上的poxB基因（locus_ tag:KPN_00904)设计引物，PCR反应结束后胶回收目的条带并测序，测序后对目的条带进 行基因分析，与MGH78578上poxB基因的相似度为100%。用同