包含突变的核酸内切酶识别区dna及其基因组编辑应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程与基因治疗领域，具体设及一种通过突变基因组编辑核酸内 切酶的祀向识别位点DNA序列，提高基因敲入效率并有效降低突变频率的方法，从而改善 基因修饰细胞、动物模型的构建与人类疾病的基因治疗。
【背景技术】
[0002] 基因组编辑（Genomeediting)是利用基因工程方法改造基因组上的特定序列，W实现特定的点突变（碱基修复），序列敲除或敲入。近些年来，基因组编辑技术得到了长 足的发展，并在很多领域大放异彩。目前，基因组编辑最主要的应用包括人类疾病的基因治 疗和基础科学研究中的基因修饰细胞、动物模型的构建。
[0003] 基因治疗是将外源正常基因或治疗性基因通过一定方式导入人体祀细胞，W达 到纠正人体的原有缺陷基因或治疗疾病的治疗方法。对缺陷基因的纠正即可W通过在原 位对缺陷基因进行修复，也可W通过在基因组其他位置引入正常基因或治疗性基因，实现 对缺陷基因的功能增强或功能缺失。在传统的研究与医学实践中，基因治疗主要通过W 下两种途径来实现：一、通过同源重组（Homologousrecombination)或基因打勒1(Gene targeting)技术原位修复缺陷基因；二、通过整合的或非整合的途径将正确基因或治疗性 基因片段导入祀细胞。传统的同源重组或基因打祀技术技术要求较高，同时效率低下。而 通过将外源基因补充到基因组的方法，虽然能一定程度治疗疾病，但并未清除缺陷基因，同 时外源基因随机整合会带来致癌等风险。高效精确地在缺陷基因原位进行修正或在特定基 因位点引入治疗性基因是最理想的基因治疗模式，同时也是目前大家研究的热点。
[0004] 基因治疗的最主要应用是治疗人类遗传病。遗传病是指遗传物质的改变（包括染 色体崎变及基因突变）而导致的疾病。例如染色体数量异常导致的21=体综合征、多基因 遗传病唇裂和皿B单基因突变导致的地中海贫血症等。由于医学的不断发展与进步，人类 已经对多种遗传病的发生过程有了比较清楚的认识，并针对性地开发了多种治疗手段用于 治疗或缓解病人的症状。例如，苯丙酬尿症和肝豆状核变性等遗传病会导致代谢阻碍或失 衡，可通过改变饮食或服用药物予W纠正、缓解。然而，运些治疗手段往往治标不治本，要么 效果有限，要么需终身防治。基因治疗是治疗遗传病的最彻底、最有效的方式。
[0005] 除遗传病之外，其他一些人类疾病也可W通过基因治疗实现最彻底的治愈。例如， 通过失活CCR5基因可W保护人类免疫系统免受艾滋病病毒的侵袭W防治传染病。通过向 患者输入表达外源抗肿瘤基因的淋己细胞可W杀死黑色素瘤等肿瘤细胞W治疗肿瘤。通过 在造血干细胞中敲入基因工程改造的特异抗体基因W消除白血病或抗感染。目前，基因治 疗大多都停留在实验室研究或动物实验上，尚未进行大规模的临床实践。
[0006] 基础科学研究中的基因修饰细胞、动物模型的构建是基因组编辑的另一大应用。 在基因功能研究中，携带特定基因修饰的细胞和动物模型是极其重要的实验材料。传统的 制备方法包括：（1)首先制备携带预期突变或修饰的基因序列，通过质粒转染或病毒转导 等途径随机整合到细胞基因组中，得到表达外源突变基因的细胞系或动物模型。（对通过 基因打祀技术在胚胎干细胞上对相应位点进行突变，得到基因突变胚胎干细胞或继而得到 相应的基因突变动物。方法（1)由于随机整合，插入位点不一，表达模式跟原基因可能不一 致。方法（2)可实现定点突变，且方法成熟，缺点是周期较长，技术要求比较高。
[0007] 利用核酸内切酶定点勒!向基因组巧ndonuclease-mediatedgenomeediting, EMGE)的技术是近年来发展起来的一种高效基因组编辑技术，可W实现随机或者特定碱 基的点突变，序列敲除或敲入。该技术利用基因组编辑核酸内切酶识别特异的基因组序 列，其内切酶活性能造成识别序列内或者附近的基因组DNA双链断裂值OUblestrand break,DSB)，然后利用细胞中的DNA修复机制实现基因组编辑（包括定点突变，序列敲除或 献入）。
[0008] 细胞中有两种主要的DNA修复机制：同源重组化omologousrecombination,HR) 和非同源重组末端连接（Non-homologousend-joining,NHEJ)。皿修复是W内源或外源 序列相同DNA为模板，W同源重组的方式修复断裂DNA，运种修复方式通常能完美修复基因 组。利用核酸内切酶介导的特定基因组区域DSB和皿的DNA修复机制能实现特定人工 DNA序列的基因组序列替换，也就是特定碱基点突变、特定人工序列的敲除或者特定人工序 列的敲入。NHEJ是无需同源重组模板直接将断裂的DNA强行连接在一起的修复方式，运种 不精确的修复方式往往会导致随机的碱基缺失、插入或突变。利用核酸内切酶介导的特定 基因组区域DSB和NHEJ的DNA修复机制能产生随机的点突变，序列敲除或敲入。
[0009]目前已经有S种能用于基因组编辑的核酸内切酶，分别是ZFN(锋指核酸内切 酶）、TALEN(转录因子激活样效应器内切酶）和CRISPR-化s9系统。ZFN和TALEN的工作 原理类似，运两类核酸内切酶均由两部分融合而成，即N端的核酸识别结构域跟C端的内切 酶化kl。ZFN是通过锋指结构域识别特定的S联体碱基，而TALEN是利用一种植物病原菌 中的TALE结构域识别单个碱基。当人工串联多个特定碱基识别的锋指结构域或TALE结构 域，便能实现识别特定碱基序列的目的。核酸内切酶化kl需形成二聚体才具有酶切活力， 能够在基因组上定点切割造成DNA双链断裂值oublestrandbreak,DSB)。因此，当成对 ZFNs或TALE化探针值NA、mRNA或蛋白）被引入细胞之后便能实现基因组定点切割，W实 现由NHEJ修复导致的基因突变或基于同源重组的基因修复、序列敲入。
[0010]CRISPR-化s9系统是最新出现的第S类基因组编辑工具。CRISPR-化s9系统源于 细菌的一种免疫防御机制，用于抵御外来质粒或病毒对细菌的侵染。该系统包括=个组分， 分别是crRNA、tracrRNA和化s9。crRNA5'端通过碱基互补配对的方式勒!向基因组特定位 点，tracrRNA通过局部互补配对结合crRNA3'端，并与核酸内切酶化s9形成复合物。随 后化s9分别在DNA的两条链上进行切割，进而形成DNA双链断裂。经过众多科学家的不断 研究与改进，将crRNA和tracrRNA融合成一条模拟其局部互补配对构象的嵌合RNA，简称祀 向RNA，也能有效地介导化s9的特异切割。即该系统可W简化为一个化s9酶和一条祀向 RNA(GuideRNA,gRNA)〇
[0011] 核酸内切酶介导的基因组编辑已被广泛应用于在不同物种（植物、动物、微生物 等），不同实验体系（细胞系、干细胞、小鼠等）中的基因敲除与基因敲入。其在人类遗传 病的基因治疗研究中也大显身手，基于定点的基因敲入技术，世界上已有多个研究组通过 ZFN、TALEN或CRISPR-化s9技术修复了地中海贫血症等疾病细胞中的基因突变。
[0012] 尽管有成功例子，但是目前基因组编辑的效率较低，尤其是利用皿的特定单碱基 或少量碱基的祀向编辑（突变或者修复）效率更差，且易引入额外的或者错误的碱基突变。 当前技术所存在的问题严重影响了其在人类疾病的基因治疗和基因修饰细胞、动物模型构 建中的广泛应用，急需克服其潜在的问题并释放出其最大的效能。如何精确且高效地进行 基于皿的基因组编辑是目前急需解决的问题。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是建立一种通过构建特殊的同源重组DNA模板，避免基因组编辑核 酸内切酶在已成功编辑（特定突变或者修复）的基因组DNA祀点上的二次切割和突变（类 似于脱祀效应），固化已成功进行的同源重组介导的基因组编辑，从而提高基因敲入效率和 正确率的方法。
[0014] 为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[0015] 本发明提供一种用作基因组编辑的同源重组模板DNA，其中，所述DNA包括1)人工 编辑的目标敲入序列；和2)突变的基因组编辑核酸内切酶的识别区；和3)两侧同源臂序 列。其中，所述1)人工编辑的目标敲入序列是来源于细胞基因组上待编辑的对应目标DNA 序列，经人工完成了所需的特定点突变（Pointmutations)、特定插入突变（Insertion)或 者特定删除突变值eletion)。对基因治疗的疾病而言，上述对应的编辑方式也称为特定碱 基修复，修复DNA片段缺失和消除DNA片段插入。所述2)突变的核酸内切酶识别区是来源 于基因组上核酸内切酶识别区域的对应DNA序列，并且在该序列上已经完成碱基突变，目 的在于避免被基因组编辑核酸内切酶识别，防止在已经完成同源重组介导的基因编辑（碱 基突变或修复）的基因组DNA上再次发生核酸内切酶介导的双链切割和NHEJ修复。所述 3)两侧同源臂序列与待编辑的细胞基因组DNA序列完全相同，其能与对应的基因组发生 同源重组，从而介导人工编辑的目标敲入序列和突变的识别区序列替代基因组中原有的对 应DNA区域。该DNA的结构与组成见图1。
[0016] 优选的，所述DNA既可W是合成的单链DNA，也可W是双链DNA。所述双链DNA既 可W是线性化的，也可W是被克隆在环状质粒中。
[0017] 优选的，目标敲入序列可位于突变的基因组编辑核酸内切酶的识别区内，也可W 位于突变的基因组编辑核酸内切酶的识别区的两侧。
[0018] 优选的，相对于待编辑细胞基因组DNA上对应序列，所述突变的基因组编辑核酸 内切酶的识别区序列具有至少1个碱基突变。
[0019] 更优选的，所述基因组编辑核酸内切酶的识别区的碱基突变原则是在不改变蛋白 编码或者基因组功能的条件下，引入足够多的突变碱基，W最大限度地避免被再次识别的 可能。
[0020] 更优选的，所述基因组编辑核酸内切酶的识别位点的碱基突变原则包括：（1)如 果识别位点位于蛋白编码区，在考虑物种密码子使用偏好的基础上按照密码子简并的规则 进行同义突变；（2)如果识别位点位于内含子，则按照不突变可能会影响mRNA剪接或其他 生物学功能的序列，而其他序列可随意突变的原则进行突变。（3)根据基因组编辑核酸内切 酶种类的不同，引入足够多的突变碱基，W最大限度地避免被再次识别的可能。
[0021] 优选的，所述基因敲入包括对特定碱基进行点突变（对疾病治疗而言，称碱基修 复），插入特定DNA片段（对疾病治疗而言，称修复DNA片段缺失）和引入特定DNA片段缺 失（对疾病治疗而言，称消除DNA片段插入）。
[0022] 优选的，所述两侧同源臂长度视目