重新接种中空纤维生物反应器系统中生长的贴壁细胞的方法
【专利说明】重新接种中空纤维生物反应器系统中生长的贴壁细胞的方 法 阳OOU 本申请是2012年10月26日递交的申请号为201180021315. 9,发明名称为"重新 接种中空纤维生物反应器系统中生长的贴壁细胞的方法"的分案申请。 柳0引优先权
[0003] 本专利申请要求于2010年5月5日提交的临时专利申请61/331，660的优先权， 且本专利申请是于2008年3月5日提交的美国专利申请12/042, 763的部分接续申请。
【背景技术】
[0004] 在多种处理和治疗中，干细胞的使用正受到越来越多的关注。干细胞可被用于修 复或替代受损或有缺陷的组织，且具有治疗大范围疾病的广泛的临床应用。
[0005] 细胞扩增系统可用于使干细胞W及其它类型的细胞（贴壁细胞和非贴壁细胞）生 长。在细胞将要生长和分裂前，贴壁细胞需要贴附的表面。而非贴壁细胞在悬浮液中漂浮 的同时进行生长和分裂。
[0006] 细胞扩增系统为生长的细胞提供营养物且移除代谢物，W及供应有助于细胞生长 的生理化学环境。细胞扩增系统在本领域是已知的。
[0007] 生物反应器或细胞生长腔体作为细胞扩增系统的组件在为扩增的细胞提供最优 化环境中起到重要作用。在本领域中已知很多类型的生物反应器。生物反应器装置包括 培养瓶、转瓶（rollerbottle)、振荡瓶（shakerflask)、揽拌槽式反应器（Stirred-tank reactor)、气升式反应器（air-liftreactor)和中空纤维生物反应器。
[0008] 一旦生物反应器中扩增的细胞达到细胞覆盖或期望的细胞数量，则需要收集细 胞，且如果期望进一步的细胞生长，则需要将细胞重新接种在相同或不同的生物反应器中。
[0009] 不管使用何种类型的生物反应器装置，为了收集贴壁细胞，必须首先从细胞生长 的表面上移除细胞。为了从生长表面移除贴壁细胞，初始清洗细胞W移除抑制膜蛋白酶的 离子（儀、巧）。然后将膜蛋白酶添加至经清洗的细胞W使细胞从表面松落。一旦细胞被松 落，则从膜表面移除它们，且通过清洗被移除的细胞或使它们旋转沉淀为细胞团、移除周围 的流体且将它们悬浮在新的生长培养基中进行处理W移除膜蛋白酶。
[0010] 该程序容易在细胞生长在平板上的开放系统（诸如培养瓶）中进行，其中该程序 在层流净化罩中进行。但是在使用中空纤维生物反应器的封闭系统中，该系统对大气是封 闭的。没有简单的方法来添加流体或从系统中移除流体，且包含在细胞生长所需的生长培 养基中的离子由于通过中空纤维的超滤而从细胞生长空间中丢失。因此细胞存活在被稀释 的培养基（来自从细胞初始清洗进入系统的添加的流体）、膜蛋白酶（来自用于使细胞从膜 松落的膜蛋白酶）、且由于超滤培养基中没有离子（例如巧和儀）围绕的环境中。
[0011] 运些因素可造成被直接重新接种在中空纤维生物反应器中的收集的贴壁细胞的 细胞生长不足。
[0012] 因此，需要开发新的重新接种的方案W在使用中空纤维生物反应器的细胞扩增系 统中使用。
【发明内容】
[0013] 本发明设及用于直接重新接种收集的在中空纤维生物反应器中生长的贴壁细胞 的方法，所述中空纤维生物反应器具有内毛细管空间（intracapillaryspace)和外毛细管 空间（extracapillaryspace)，其中细胞生长空间是内毛细管空间或外毛细管空间中的一 种。该方法包括W下步骤：从所述细胞生长空间移除生长培养基；清洗所述细胞W从所述 细胞生长空间移除残留的生长培养基；通过将膜蛋白酶添加至所述细胞生长空间，使所述 细胞从中空纤维生物反应器的中空纤维上松落；从所述细胞生长空间移除细胞和所有膜蛋 白酶；使来自被移除的细胞中的膜蛋白酶失活；W及，将被移除的细胞和膜蛋白酶直接重 新接种在中空纤维生物反应器的细胞生长空间中。
[0014] 本发明还要求了一种制造收集培养基的方法，所述方法通过使用ChVh+0v@^= CfVh+CcVc计算培养基中需要的离子和蛋白质的量，且将计算出的量的离子和蛋白质加入培 养基中，W在将贴壁细胞直接重新接种在中空纤维生物反应器中使用。
【附图说明】
[0015] 图1为在本发明中有用的中空纤维生物反应器的示例图。
[0016] 图2示出了可被本发明使用的细胞扩增系统的示例图。
[0017] 图3是在根据本发明完整重新接种的程序之前、过程中及之后的代谢浓度的示 图。
【具体实施方式】
[0018] 本申请大体设及用于收集和/或重新接种来自封闭细胞扩增系统的中空纤维细 胞生长腔体/生物反应器的贴壁细胞（尤其为间充质干细胞）的无菌方法。封闭系统指该 系统没有直接暴露于大气。
[0019] 从细胞扩增系统收集扩增的细胞包括从生物反应器中移除所有扩增的细胞。重新 接种收集到的细胞包括：将所有被移除的细胞重新装载在相同或不同的生物反应器中W用 于进一步扩增；或，将收集到的细胞的一部分重新装载在相同或不同的生物反应器中，同时 保留被移除细胞的剩余部分用于随后的应用。
[0020] 现在参考图1，在正面立视图中示出了可被本发明使用的中空纤维细胞生长腔体 100的实例。细胞生长腔体100具有纵向轴LA-LA，且包括细胞生长腔体的壳体104。在至 少一个实施方式中，细胞生长腔体的壳体104包括四个开孔（opening)或端口（port)JC 入口 108、IC出口 120、EC入口 128和EC出口 132。应注意在附图中，相同的元件由相同的 标记表示。箭头示出了流体流过生物反应器100 (图1)和细胞扩增系统200 (图2)的方向。
[0021] 多个中空纤维116被配置在细胞生长腔体的壳体104内。用于制造中空纤维116 的材料可W是能够被制成中空纤维的任何生物相容的聚合材料。术语"中空纤维"、"中空纤 维毛细管"和"毛细管"可互换使用。多个中空纤维被称为膜。
[0022] 中空纤维116的末端可通过连接材料（本文中还被称为"灌封料（potting)"或 "灌封材料"）被灌封至细胞生长腔体的壳体104的末端。灌封料可为用于粘合中空纤维116 的任何适当的材料，但条件是不阻塞培养基（和如果期望的细胞）进入中空纤维的流动。 示例性的灌封材料包括（但并不限于）聚氨醋或其它适当的粘合或粘附组分。端盖112和 124被分别配置在传质装置（masstransferdevice)的每一端。
[0023] 第一循环路径202 (见图2)中的细胞生长培养基通过在细胞生长腔体100的第一 纵向末端112处的IC入口 108穿入细胞生长腔体100,进入且穿过中空纤维116的毛细管 内侧（在各实施方式中被称为毛细管内（"1C")侧或"IC空间"），且通过位于细胞生长腔 体100的第二纵向末端124的IC出口 120穿出细胞生长腔体100。在IC入口 108和IC出 口 120之间的流体路径限定了细胞生长腔体100的IC部分126。
[0024] 第二循环路径204 (见图2)中的流体通过EC入口 128流入细胞生长腔体100,与 中空纤维116的毛细管外侧或外部（被称为"EC侦r或"EC空间"）接触，且经由EC出口 132离开细胞生长腔体100。EC入口 128和EC出口 132之间的流体路径包括细胞生长腔体 100的EC部分136。经由EC入口 128进入细胞生长腔体的流体与中空纤维116的外部接 触。
[00巧]小分子（例如离子、水、氧气、乳酸盐等）可通过中空纤维从IC空间扩散至EC空 间，或从EC空间扩散至IC空间。大分子量的分子（诸如生长因子）通常太大而不能穿过 中空纤维膜，因此留在中空纤维的IC空间中。可根据需要替换培养基。培养基还可通过气 体转移组件/氧合器232进行循环W根据需要交换气体。
[00%] 在不背离本发明的精神和范围的情况下，细胞通常被容纳在第一循环路径202中 的中空纤维的IC空间内，但还可被容纳在第二循环路径204中的EC空间内。不管细胞生 长在IC空间还是生长在EC空间中，细胞均生长在细胞生长空间中。
[0027]用于制造