一种青花菜发育膨大小孢子分离的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种青花菜发育膨大小孢子分离的方法。
【背景技术】
[0002]青花菜(B rassica oleracea L.var.1 talica)又名西兰花、绿菜花、莖椰菜等，以主茎及侧枝顶端形成的绿色花球为产品，营养丰富，色、香、味具佳，是国际市场十分畅销的一种名特蔬菜。目前我国青花菜主栽品种大都来自国外，具有自主知识产权的品种匮乏，主要因为育种资源少，难以配制好的品种。传统上，多代自交分离一般需要5~6年的时间才能获得纯合稳定的亲本材料。费力耗时。而游离小孢子培养方法可在1~2年内快速获得双单倍体纯系，比传统的方法缩短了 3~4年的时间。因此在优良自交系的创制和提高新品种选育效率等方面具有重要作用。同时，隐性性状也易于表达，丰富了育种资源。
[0003]自1982年Lichter首次报道获得甘蓝型油菜小孢子再生植株以来，十字花科植物，尤其是油菜的小孢子培养，无论是在出胚率、出胚量，还是胚培养及再生植株方面都获得了很大的成功。青花菜游离小孢子培养，国外研究最早见于Takahata等(1991)报道，国内则是张德双等于1997年在巴绿青花菜等品种的研究上获得成功。随后，张延国等(2005)、方淑桂等(2005)、袁素霞等(2009)、张振超等(2013，2014)也做了大量研究，培养效率得到一定程度提高。
[0004]有关小孢子胚胎发育过程中的分子生物学、蛋白质组学等机理研究较少，究其原因是小孢子体积微小，要获得足够数量的试验材料需要做大量、重复的小孢子培养试验，而把发育膨大的小孢子与未发育的小孢子分离开存在困难。根据小孢子直径大小而采用不同孔径的微孔滤网过滤的方法可以简便有效的把发育膨大的小孢子分离出来，从而为青花菜小孢子胚胎发育机理研究提供足够的试验材料，具有重要的实践意义。
[0005]
【发明内容】
[0006]针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种青花菜发育膨大小孢子分离的方法，根据发育膨大小孢子与未发育小孢子直径差异，采用不同孔径微孔滤网过滤的方法可以简便有效的把发育膨大的小孢子分离出来，从而为小孢子胚胎发育机理研究提供试验分析材料。
[0007]—种青花菜发育膨大小孢子分离的方法，包括以下步骤:
步骤I，取青花菜花蕾在无菌环境下灭菌处理，得无菌花蕾；
步骤2，向无菌花蕾中加入NLN-13液体诱导培养基，研磨成悬浮液后过滤，将滤液离心，并向离心后的沉淀中加入NLN-13液体诱导培养基，得小孢子悬浮液；
步骤3，将小孢子悬浮液分装到无菌培养皿中，置于黑暗中32°C?33°C下热激处理I?3天后，备用； 步骤4，将热激处理后的无菌培养皿继续置于黑暗中，23?27°C培养I?10天，再用显微镜观察小孢子发育情况，并利用微孔滤网进行梯度过滤，得发育膨大的小孢子；
步骤5，将发育膨大的小孢子用蒸馏水洗脱到离心管中离心，倾去上清液，连同离心管置于液氮中保存备用。
[0008]作为优选的是，步骤I中所述青花菜花蕾处于单核晚期至双核早期，花瓣和花药长度比为0.85?1.15。
[0009]作为优选的是，步骤I中所述灭菌处理是将青菜花花蕾在无菌操作台上先用灭菌液灭菌，再用无菌水震荡清洗3?5次，所述灭菌液灭菌为质量百分浓度为5.6%次氯酸钠配制而成灭菌18?20分钟，或用质量百分浓度为0.1%氯化汞配制而成，灭菌10?15分钟。
[0010]作为优选的是，步骤2中所述NLN-13诱导培养基由NLN液体培养基IL和蔗糖130g 组成，pH 6.0 ?6.2 ;
所述的NLN液体培养基，以IL计，组成为=KNO3 125mg，Ca(NO3)2.4H20 500mg，MgSO4.7H20 125mg，KH2PO4 125mg，H3BO3 6.2mg，MnSO4.H2O 18.95mg，ZnSO4.7H20 8.6mg，Na2MoO4.2H20 0.25mg，CuSO4.5H20 0.025mg，CoCl2.6H20 0.025mg，维生素 BI 0.5mg，维生素 B6 0.5mg，生物素 0.05mg，叶酸 0.5mg，Na2EDTA 37.3mg，FeSO4.7Η20 27.8mg，肌醇 lOOmg，甘氨酸2mg，烟酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，维生素B5 5mg，丝氨酸lOOmg，余量为无菌水。
[0011]作为优选的是，步骤4中所述的梯度过滤为将黑暗中23?27°C培养I?10天的小孢子悬浮液，先用300?350目滤网过滤，以除去体积较大的物质，滤液用NLN-13液体诱导培养基悬浮后用450?600目滤网过滤，重复2?3次得发育膨大的小孢子。
[0012]作为优选的是，步骤4中所述发育膨大的小孢子是指热激处理后在20倍显微镜下随机观察10个视野，发育膨大小孢子数量占全部小孢子的比例超过5%。
[0013]作为优选的是，步骤4中梯度过滤为真空抽滤，所用真空度为20_50kpa。
[0014]
有益效果
1、本发明针对青花菜发育膨大小孢子分离困难的问题，提供了一种根据发育和未发育小孢子直径大小差异，采用不同孔径微孔滤网过滤分离的方法，把发育膨大小孢子与未发育小孢子分离开，从而获得足够数量的试验材料。通过本方法获得的小孢子试验材料中，发育膨大的小孢子数量占比提高到80%以上，而未通过不同孔径滤膜梯度过滤对照最高仅为15%。
[0015]2、通过大量重复进行小孢子培养操作、微孔滤网过滤分离，获得了足够数量的试验材料，为分子生物学、蛋白质组学研究提供了保障。
[0016]
【具体实施方式】
[0017] 实施例1
步骤1，取青花菜生长健康、无病虫害的花序作为小孢子培养的供体植株，取花序上花瓣和花药长度比为0.85、单核晚期至双核早期的花蕾，在超净工作台上把青花菜花蕾放入无菌培养皿中，加入灭菌液，放到摇床上摇动进行表面消毒20分钟，再用无菌水荡洗3次后，备用，其中，灭菌液由次氯酸钠水溶液56ml/L、无水乙醇100ml/L、洗洁精10滴/L、无菌水配制成；
步骤2，在超净工作台上将12个无菌花蕾置于无菌烧杯中，加入1ml NLN-13液体诱导培养基，用平头玻璃棒挤碎、研磨成悬浮液，该悬浮液用300目无菌滤网过滤到50ml离心管中，盖紧，900rpm/min离心3min，离心后倒掉上清液，往沉淀中加入1ml NLN-13液体诱导培养基，按上述方法再离心2次，弃上清液；加入NLN-13液体诱导培养基40ml，得到小孢子悬浮液，其中，NLN-13液体诱导培养基:NLN液体培养基IL+蔗糖130g/L，pH6.0，过滤灭菌；
其组成为:KN03 125mg，Ca (NO3) 2.4H20 500mg，MgSO4.7H20 125mg，KH2PO4 125mg，H3BO36.2mg，MnSO4.H2O 18.95mg，ZnSO4.7H20 8.6mg，Na2MoO4.2H20 0.25mg，CuSO4.5H200.025mg，CoCl2.6H20 0.025mg，维生素 BI 0.5mg，维生素 B6 0.5mg，生物素 0.05mg，叶酸0.5mg，Na2EDTA 37.3mg，FeSO4.7H20 27.8mg，肌醇 lOOmg，甘氨酸 2mg，烟酸 5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，维生素B5 5mg，丝氨酸10mg和余量无菌水；
步骤3，将小孢子悬浮液分装到60mm无菌培养皿中，每培养皿加4ml小孢子悬浮液，加盖后用parafilm膜封口，后置于32.5°C恒温生化培养箱里、黑暗条件下热激处理I天；步骤4，将热激处理后的无菌培养皿继续置于黑暗中25°C下培养3天，当显微镜观察发现小孢子胚胎发育率超过5%时，把小孢子悬浮液先用300目滤网过滤，以除去体积较大的物质，滤液用NLN-13液体诱导培养基悬浮后用450目滤网过滤，获得的沉淀用NLN-13液体诱导培养基悬浮后过滤，重复2次，最终获得的沉淀即为发育的小孢子；
步骤5，将发育膨大的小孢子用蒸馏水洗脱到离心管中离心，倾去上清液，把离心管置于液氮中保存备用。
[0018]结果:通过本方法获得的小孢子试验