一种高纯度重组人血小板源性生长因子bb的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域中一种包含重组人血小板源性生长因子B链的融合蛋 白及其编码基因与重组人血小板源性生长因子BB的制备方法。
【背景技术】
[0002] 人血小板源性生长因子（PDGFs)是贮存于血小板a颗粒中的一种碱性蛋白质。能 刺激停滞于G0/G1期的成纤维细胞、神经胶质细胞、平滑肌细胞等多种细胞进入分裂增殖 周期，它向间质源细胞施以有力的促有丝分裂和趋化活性。TOGFs在胚胎发育、细胞分化和 对组织损伤的反应等过程中具有许多极为重要的作用。它是创面愈合过程中较早出现的生 长因子之一。特别是对一些慢性难愈性伤口，如糖尿病溃疡、慢性静脉性溃疡、压疮、放射性 溃疡等均有明显促进愈合作用。
[0003] 人血小板源性生长因子在人体内有三种活性形式分别是：TOGF-AA、TOGF-AB、 TOGF-BB，其中TOGF-BB活性最高。TOGF-BB，是一种同源二聚体蛋白质，依靠两条多肽链间 两对二硫键链接，同时，两条多肽链链内各有三对二硫键。
[0004] 1998与1999年美国药品食品监督管理局（FDA)与欧洲药品评价局（EMEA)先后 批准酵母表达的重组人血小板源性生长因子BB (rhPDGF-BB)用于糖尿病足的治疗，商品名 为贝卡普明。在2005年-2012年间，美国FDA、加拿大、欧盟EMEA、澳大利亚等国先后批准 rhH)GF-BB用于牙龈萎缩及牙骨缺失的治疗（商品名为GEM21S)。GEM21S为rhH)GF-BB与 磷酸三钙的组合医疗器械，用于患处时，rhH)GF-BB可迅速从产品中释放至患处及周围 组织中，发挥其趋化性、促细胞分裂的作用，促进牙周组织、成骨细胞再生，并向患处聚集， 形成新牙周组织和牙骨质附着层。
[0005] 尽管rhH)GF-BB在临床可用于治疗糖尿病足和牙周疾病，解决患者疾苦，但是当 前上市产品仍存在质量风险。主要表现为rhH)GF-BB在酵母表达过程中，受蛋白酶作用导 致降解。降解位置主要发生在N端第5和6位氨基酸之间，由于仅相差5个氨基酸，利用目 前的纯化方法难以分离，导致成品蛋白质分子中，存在两条肽链N端不均一的产物。在EMEA 对GEM21S的评审报告中，要求研发企业采取有效手段来控制降解产物含量。但是研发企业 尽管采取了工程菌改造、高选择性色谱纯化等手段和措施，在已上市产品中仍然存在N端 不均一产物，并有可能影响产品活性。
[0006] 本发明针对上述技术难题，提供一种新的高纯度rhTOGF-BB的制备方法，解决了 上市的同类产品N端不均一及活性等问题。通过融合表达技术，增加降解产物与未降解产 物的理化性质差异，并进一步通过纯化彻底分离不均一产物，实现产物N端完全均一。通过 选择合适的融合标签，保证其生物活性与天然蛋白一致。且融合标签为在毕赤酵母中高效 表达的蛋白，同时增加目的蛋白的表达量，明显提高得率。为rhH)GF-BB与磷酸三钙组 合，开发三类医疗器械，解决瓶颈技术问题，奠定了基础。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种优化的编码重组人血小板源性生长因子B链的核酸 分子。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种融合标签蛋白，该融合标签分子能促进重组人血 小板源性生长因子BB的表达，且不影响重组人血小板源性生长因子B链自发形成具有生物 活性的高级结构。
[0009] 本发明的另一目的在于提供一种宿主细胞，其能够表达包含上述融合标签和重组 人血小板源性生长因子B链的融合蛋白。
[0010] 本发明的另一目的在于利用上述宿主细胞制备N端完全均一的高纯度的重组人 血小板源性生长因子BB。
[0011] 本发明采用的技术方案是：
[0012] 一种经优化的编码重组人血小板源性生长因子B链的核酸分子，其具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0013] -种融合标签蛋白，包括来源于酿酒酵母的葡糖淀粉酶或其片段；优选地，所述融 合标签蛋白为来源于酿酒酵母的葡糖淀粉酶（GenBank :AAA20560. 1)的第367-482位氨基 酸，并且其中，所述葡糖淀粉酶的第415位天冬氨酸被突变为丝氨酸，第435位天冬氨酸被 突变为甘氨酸；更优选地，所述融合标签的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。编码所述融合 标签的核酸分子具有SEQ ID N0. 3所示的核苷酸序列；优选地，所述核酸分子的核苷酸序列 如SEQ ID N0. 3所示。所述融合标签促进重组人血小板源性生长因子BB高效表达，其不影 响重组人血小板源性生长因子B链自发形成具有生物活性的同源二聚体高级结构。
[0014] 一种包含重组人血小板源性生长因子B链的融合蛋白，其为通过接头（Linker)将 上述融合标签融合至所述人血小板源性生长因子B链N端，其中所述接头包含酶切位点； 优选地，所述酶切位点位于接头C端；优选地，所述酶切位点为肠激酶酶切位点；优选地，所 述接头还包含柔性连接肽-(GGS) n-、组氨酸标签或其组合；优选地，所述接头的氨基酸序 列为-GGSHHHHHHGGSGGSGSEFDDDDK-，其编码核酸序列为 GGAGGITCCCATCACCATCACCATCACGG AGGTTCTGGAGGTTCTGGTTCCGAATTCGATGACGATGACAAG ;优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID N0. 4所示；优选地，所述融合蛋白以单体或二聚体形式存在。编码所述融合蛋白的 核酸分子，优选地，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示。
[0015] -种包含编码上述融合蛋白的核酸分子的载体。优选地，所述载体为表达载体；优 选地，所述表达载体选自PPIC9、pPIC9K、pPICZ a A、pPICZ a B、pPICZ a C、pPICZA、pPICZB、 pPICZC或pPIC3. 5K。
[0016] -种包含所述载体的宿主细胞，其能够表达所述融合蛋白。优选地，所述宿主细胞 为细菌或真菌；优选地，所述宿主细胞为酵母；优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母；优选地， 所述毕赤酵母选自GS115、X-33、KM71或SMD1168。。
[0017] -种制备所述融合蛋白的方法，其包括，培养所述的宿主细胞，和，从所述宿主细 胞的培养物中回收所述融合蛋白；优选地，所述融合蛋白被分泌到宿主细胞的胞外或者在 宿主细胞的胞内表达。
[0018] -种重组人血小板源性生长因子BB的制备方法，其主要步骤包括：
[0019] 1)培养表达所述融合蛋白的宿主细胞；
[0020] 2)从所述宿主细胞的培养物中回收所述融合蛋白；
[0021] 3)对回收的融合蛋白进行酶切，并从酶切产物中回收重组人血小板源性生长因子 BB；
[0022] 优选地，所述融合蛋白经肠激酶酶切。
[0023] 本发明的有益效果是：
[0024] 通过接头将融合标签融合至人血小板源性生长因子B链N端形成融合蛋白，进行 融合表达，使得发生降解和未降解产物理化性质差距拉大，从而利用纯化手段将发生降解 和未降解产物完全分离，得到N端完全均一的人血小板源性生长因子BB，解决了目前国内 外存在的技术难题。
[0025] 通过接头序列-GGSHHHHHHGGSGGSGSEFDDDDK-实现融合表达，其包含柔性连接 肽-(GGS) n-，使得融合标签未对目的蛋白高级结构的形成造成影响，重组人血小板源性生 长因子B链能自发形成具有生物活性的同源二聚体；包含组氨酸标签，利于纯化，提高收 率；包含肠激酶位点-DDDDK-，使得融合标签被有效去除，最终获得的重组人血小板源性生 长因子BB的N端序列与天然hPDGF-BB完全一致。
[0026] 对编码人血小板源性生长因子B链的核酸及编码融合标签的核酸的核苷酸序列 进行优化，同时选择的融合标签为可以在宿主细胞，尤其是毕赤酵母中实现高效表达的酿 酒酵母葡糖淀粉酶或其片段，使得重组人血小板源性生长因子BB高效表达。
[0027] 利用本发明的方法制备重组人血小板源性生长因子BB，rhTOGF-BB表达量不低于 可溶蛋白的20 %。最终得率为500mg/L发酵液，N端完全均一，纯度大于98 %，生物活性为 80万IU/mg-100万IU/mg，内毒素小于0. 5EU/mg。制备的rhH)GF-BB满足与0 -磷酸三钙 组合，用于三类医疗器械开发的需求。
[0028] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进一步详细说明。应当理解，此处说描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
【附图说明】
[0029] 图1为优化的人TOGF-B基因序列与天然TOGF-B基因序列比对分析（优化：优化后 的F>DGF-B基因序列；天然：GenBanK公布的天然F>DGF-B基因序列；Consensus:相同序列）
[0030] 图2为优化的人TOGF-B基因序列编码的氨基酸序列与天然TOGF-B的氨基酸序列 比对分析（优化seq:优化后的TOGF-B基因编码的氨基酸序列；天然seq :GenBanK公布的 天然I^DGF-B氨基酸序列；Consensus:相同序列）
[0031] 图3为本发明构建的表达质粒pPIC9-PDGF的结构图；
[0032]图4为本发明构建的毕赤酵母表达工程菌摇瓶诱导筛选结果；
[0033] 图5为原液SDS-PAGE非还原性电泳纯度检测结果，M为蛋白质分子量标准，1泳道 和2泳道为经纯化超滤脱盐获得的原液，电泳进样量分别为5 y 1和10 y 1，纯度大于98%;
[0034] 图6为原液SDS-PAGE还原性电泳检测结果，M为蛋白质分子量标准，1泳道为原液 还原性电泳检测结果，表观分子量为14kD;
[0035] 图7为原液SEC-HPLC检测结果，纯度大于98 % ;
[0036] 图8为原液生物活性测定标准曲线。
【具体实施方式】
[0037] 实施例1重组人血小板源性生长因子BB融合蛋白工程菌构建
[0038] 1、pPIC9-PDGF/GS115 工程菌构建
[0039] 人血小板源性生长因子BB单链全长序列为241个氨基酸。成熟蛋白序列为去掉 信号肽和前导肽的序列，包括第82位至190位序列，共109个氨基酸。优化改造人血小板 源性生长因子BB成熟蛋白的基因序列，综合考虑在毕赤酵母中表达的密码子偏好性、基因 GC含量、CpG含量、mRNA二级结构、序列内含子剪接位点、RNA结构不稳定序列、非转录终止 区的转录终止序列、长的重复序列等与基因表达序列相关的因素。对核酸序列进行同义突 变，优化后的基因序列如SEQ ID NO. 1所示，其与天然的人TOGF-B序列（GenBank登录号： AH003517. 1)不同，只有74%同一性，如图1所示。但优化基因编码的氨基酸序列与天然序 列保持一致，如图2所示。
[0040] 融合标签选取来源于酿酒酵母葡糖淀粉酶（GenBank :AAA20560. 1)的第367-482 位氨基酸，并将415位天冬氨酸突变为丝氨酸，435位天冬氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序 列如SEQ ID N0. 2所示。并根据上述基因序列优化方法进行基因优化，优化后的编码基因 核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示。
[0041]选择接头序列-GGSHHHHHHGGSGGSGSEFDDDDK-，对应的核酸序列为 GGAGGTTCCCATC ACCATCACCATCACGGAGGITCTGGAGGITCTGGITCCGAATTCGATGACGATGACAAG。用接头将人血小板源 性生长因子B链的N端连接上融合标签，所获融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。 所述融合蛋白的编码核酸序列如SEQ ID N0. 5所示。其通过在所述融合蛋白对应的编码核 酸序列的5'端加h.序列CTCGAG[