转基因水稻pa110-15外源基因纯合杂合状态的pcr检测引物的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种转基因水稻外源基因插入的纯合/杂合状态检测的方法，特别涉 及转基因水稻PA110-15外源基因纯合杂合状态的PCR检测引物及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 标准物质是食品、农产品中转基因成分检测的"金标准"，是依法开展转基因生物 安全监管的重要物质基础。转基因成分检测标准物质研制对原材料的均匀性、稳定性、特征 量值范围等方面有严格要求。目前，国内外转基因成分检测普遍采用基于核酸的定性、定量 检测方法。其中定量检测通常采用Real Time-PCR方法对样品中靶标核酸序列进行绝对定 量，即测定外源DNA插入特征序列的拷贝数，并以此为基础计算样品中转基因成分的含量。 在转基因成分检测中，可以将外源DNA看作一个基因座位，一个纯合体的2倍体基因组中检 测靶标核酸序列，即外源DNA插入特征序列的拷贝数为2, 一个杂合体的2倍体基因组中外 源DNA插入特征序列的拷贝数为1，非转基因材料中则为0。因而，转基因检测标准物质制 备原材料的均匀性、稳定性、特征量值范围主要体现在外源DNA插入所产生的特征序列的 杂合或纯合状态。在标准物质的研制过程中，必需对原材料中靶标核酸序列的遗传特性进 行确认，即确认外源DNA插入所产生的特征序列是纯合还是杂合状态。
[0003] 此外，在转基因作物遗传育种过程中，往往需要将转基因材料与其它材料进行杂 交、转育以获得适合的栽培品种，利用分子生物学手段快速、简便鉴定纯合体/杂合体育种 材料，也有利于缩短育种进程。
[0004] 目前，已报道的转基因成分检测方法，主要包括针对外源目的基因、调控元件的筛 选检测和基因特异性检测，针对遗传转化载体构建特征的构建特异性检测，针对外源DNA 插入特征序列的品系特异性检测等三类。利用以上方法，只能确定样品中是否含有转基因 成分或含有何种转基因成分，但无法直接鉴别样品中外源DNA插入的纯合或杂合状态。迄 今未止，国内外目前还没有针对转基因水稻PA110-15外源基因纯合/杂合状态的检测方 法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供检测转基因水稻PA110-15外源基因插入的纯合/杂合状 态的PCR检测引物。
[0006] 本发明的目的还在于提供转基因水稻PA110-15外源基因插入的纯合/杂合状态 的PCR检测方法。
[0007] 本发明的目的还在于提供转基因水稻PA110-15外源基因插入的纯合/杂合状态 的PCR检测试剂盒。
[0008] -种转基因水稻PA110-15外源基因纯合杂合状态的PCR检测引物，所述引物为： PA110-LA-F，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1所示；PA110-LA-R，其核苷酸序列如序列 表 SEQ ID No. 2 所示。
[0009] 专利CN201410081893公开的了转基因水稻PA110-15外源插入片段旁侧序列及应 用。本发明根据PA110-15外源插入片段旁侧序列信息，在水稻染色体部分设计出一对能够 准确检测转基因水稻PA110-15外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测引物。
[0010] 一种转基因水稻PA110-15外源基因纯合杂合状态的PCR检测方法，按照如下步骤 进行：
[0011] (1)提取待检测水稻样品的DNA ;
[0012] (2)以提取的DNA为模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列为扩 增引物，建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；
[0013] (3)如果仅扩增出一条3856bp片段，则待检测的样品为纯合转基因水稻 PA110-15 ;如果扩增出3856bp和751bp的两条片段，待检测的样品为杂合转基因水稻 PA110-15 ;如果只扩增出一条751bp片段，待检测的样品为非转基因水稻。
[0014] 其中，所述的从待检测水稻样品中提取DNA的方法，可以是从植物材料中提取DNA 的各种常用方法，例如可以是CTAB法、SDS法或经验证适用于植物DNA提取的试剂盒等各 种方法。
[0015] 所述PCR扩增体系按照以下方式建立：反应体系的总体积为25. OyL，其中， 10XLA Taq Buffer II(Mg 2+Plus)缓冲液 2.5yL，5U/yL 的 TaKaRa LA Taq 聚合酶 0.25yL，dNTP Mixture(2.5mM each)4.0yL，10ymol/L SEQ ID No.l 所示的引物 lyL， 10 4!11〇1/13￡0 10吣.2所示的引物11^，25即/1^0嫩模板2 1^，余量为双蒸水。
[0016] 所述PCR扩增的条件为：94°C变性 lmin ;98°(：，1〇8,66°(：，5111111，30个循环；72°(：延 伸 10min〇
[0017] -种转基因水稻PA110-15外源基因纯合杂合状态的PCR检测试剂盒，包括： 10XLA Taq Buffer II 缓冲液，TaKaRa LA Taq 聚合酶，dNTP Mixture，引物和双蒸水；所 述引物的核苷酸序列为序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的序列。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明检测方法能够准确的检测出 转基因水稻PA110-15外源基因插入的纯合/杂合状态，为转基因水稻PA110-15成分检测 标准物质研制、转基因定量检测、样品鉴定奠定了基础。
【附图说明】
[0019] 图1是PCR方法鉴定转基因水稻PA110-15纯合体琼脂糖凝胶电泳图；
[0020] 图中，M :1Kb plus DNA Marker ;1 :空白对照；2 :PA110-15 受体；3 :PA110-15 纯合 体；4 :PA110-15受体和PA110-15纯合体混合样品。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合附图，对本发明的【具体实施方式】进行详细描述，但应当理解本发明的保 护范围并不受【具体实施方式】的限制。
[0022] 实施例1转基因水稻PA110-15外源基因纯合/杂合状态的PCR检测方法的建立
[0023] 1、引物设计及序列
[0024] 该转化体外源整合结构位于水稻基因组4号染色体上，其中，引物PA110-LA-F位 于5'端水稻基因组上；引物PA110-LA-R位于3'端水稻基因组上。
[0025] 引物序列
[0026] PA110-LA-F ：TCGATCAGTGCATCTGCTGTGGCT(SEQ ID No. 1)〇
[0027] PA110-LA-R ：TCATACATAGGAATGCGAAGCCGAAGAT(SEQ ID No. 2)〇
[0028] 2、PCR扩增反应体系及反应程序：
[0029] 反应体系：10XLA Taq Buffer II(Mg 2+Plus)缓冲液2. 5yL，TaKaRa LA Taq(5U/ y L)聚合酶 0? 25 y L，dNTP Mixture (2. 5mM each) 4. 0 y L，10 y mol/L SEQ ID No. 1 所示的 引物11^，10 4111〇1/13￡0 10吣.2所示的引物11^，25即/1^0嫩模板2 1^，用去离子水 补至25yL。
[0030] 由于扩增大的基因片段出现假阴性的概率较大，常常将杂合转基因水稻误认 为是非转基因水稻，因此，有必要优化一下反应体系，使得出现假阴性的概率降低，通 过反复实验，摸索出来一套假