一种测定枯草芽孢杆菌毒性的实验方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境污染检测技术领域，涉及一种测定枯草芽孢杆菌毒性的试验方 法。
【背景技术】
[0002] 实验室条件下进行化合物的生物效应检测，可为化合物的环境排放标准提供科学 依据。由于微生物生长周期短，测试方法简单，测试成本低，又有着与高等生物类似的理化 特性和酶作用过程，因此以微生物作为受试生物的毒性测试方法在环境领域有着广泛的应 用。
[0003] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)广泛存在于土壤、湖泊、海洋和动植物体的体 表，自身没有致病性，只具有单层细胞外膜，对人畜无害且不污染环境，具有耐高温、耐酸碱 和耐挤压等特性，目前已被作为革兰氏阳性菌毒性测试的模式菌株，广泛应用于各类化合 物的毒性检测[1-3]。
[0004] 枯草芽孢杆菌毒性测试尚未有统一的标准方法，目前常用方法[4-7]主要有：（1) 平板计数法，即根据每个活菌能长出一个菌落的原理，将不同菌悬液进行平板培养，根据长 出的菌落数算出培养物中的活菌数；（2)抑菌圈测定法（琼脂扩散纸片法），根据测定涂布 于琼脂平皿上菌悬液培养后菌落直径大小确定化合物对微生物生长的抑制；(3)比浊法， 测定原理为菌悬液中细菌数量与菌液浊度呈线性关系；(4)分光光度法，其原理与比浊法 类似，根据菌悬液中细菌数量与菌液吸光值呈线性关系，通过测定菌液吸光值进而得出菌 液中活菌的数量。
[0005] 以上枯草芽孢杆菌毒性测定方法目前较为普遍使用，但均存在一定缺陷。如平板 计数法一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确，并且此法 仅限于测定形成菌落的微生物，操作费时且结果误差较大；抑菌圈测定法对实验无菌操作 要求较高，测定菌落直径误差较大；比浊法和分光光度法即时性差，操作繁琐，所需样品量 大，实验再现性较为困难。
[0006] 在环境领域，实验室进行化合物对生物的毒性效应研究已成为化合物生态风险评 价和制定环境标准的重要科学依据。枯草芽孢杆菌作为革兰氏阳性菌的模式生物，常作为 模式生物用于各类化合物的毒性效应检测，但是目前对于枯草芽孢杆菌的毒性测试尚未形 成标准方法。因此，需建立一种枯草芽孢杆菌毒性测试方法以实现：（1)受环境因素干扰 少，不易感染杂菌；（2)检测快速，操作简单，节约工作时间及空间；(3)减少样品量以节约 实验材料；（4)减少因人为操作带来的结果误差等。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于为克服上述现有技术的缺陷而提供一种测定枯草芽孢杆菌毒 性的实验方法。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] 本发明中，采用酶标仪对样品进行检测，其测定原理建立在物质吸收光谱及可见 光比色技术基础之上。
[0010] -种测定枯草芽孢杆菌毒性的实验方法，其包括以下步骤：
[0011] (1)菌种复苏与传代；
[0012] (2)工作菌液的培养及平衡
[0013] (3)化合物对步骤⑵的平衡菌液进行毒性测试；
[0014] (4)毒性反应后检测试样0D620进行毒性表征。
[0015] 所述步骤（1)中的菌种复苏与传代
[0016] 在固体斜面培养基上进行，将枯草芽孢杆菌冻干粉（购自中国科学院微生物所菌 种保藏管理委员会）溶解，接种到斜面上传代3次后获得稳定生长的菌株F 3，置于4°C冰箱 保存备用；
[0017] 其中，固体斜面培养基配方为：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g，酵母提取物5. 0g，葡萄 糖5. 0g，NaC15. 0g，蒸馏水1. 0L，琼脂15. 0g ;所述固体培养基用lmol/L NaOH调pH至7. 0。
[0018] 所述步骤（2)中的工作菌液培养及平衡，具体包括以下步骤：
[0019] (2a)培养工作菌液
[0020] 将传代至F3的菌株用接种环接种到5mL液体培养基中，在温度为37°C，培养箱转 速180r/min条件下培养6~8h，以作为毒性测试的工作菌液；
[0021] 液体培养基配方为：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g，酵母提取物5. 0g，葡萄糖5. 0g， NaC15. 0g，蒸馏水1. 0L ;所述液体培养基用lmol/L NaOH调pH至7. 0 ;
[0022] (2b)平衡工作菌液
[0023] 按照十万分之一的稀释量移取步骤（2a)的工作菌液到无菌水中，控制稀释后工 作菌液细菌数为1〇 3个/mL，磁力搅拌器搅拌40min，以使得菌液稳定。
[0024] 所述步骤（3)中的化合物毒性反应在96孔微孔板中进行，具体包括以下步骤：
[0025] 设置96孔板加样顺序，控制每孔加样总体积量为200 ii L，即80 ii L测试化合物 (根据配制化合物母液浓度及设置的化合物不同浓度梯度，孔板内加入不同体积的化合物 溶液，不足80 ii L的用无菌水补充至80 ii L)，80 ii L高倍液体培养基及40 ii L步骤（2b)的 平衡菌液。
[0026] 所述高倍培养基（2. 5倍）是为保证慢性毒性反应（12h)过程中菌体生长所需正 常营养量。
[0027] 高倍液体培养基配方：牛肉膏12. 5g，蛋白胨25. 0g，酵母提取物12. 5g，葡萄糖 12. 5g，NaC112. 5g，蒸馏水1. 0L ;高倍液体培养基用lmol/L NaOH调pH至7. 0。
[0028] 所述的96孔板加样顺序为：
[0029] 外围一圈加入200 ii L无菌水以防止孔板边缘效应；
[0030] 第2列为空白组（120 y L无菌水，80 y L高倍液体培养基），以测得相同培养条件 下培养基基底〇D62。，从而得到化合物对菌体生长的绝对抑制率；
[0031] 第3, 7,11列为对照组（80 ii L无菌水，80 ii L高倍液体培养基，40 ii L工作菌液）， 表征相同培养条件下菌体正常生长量；
[0032] 第4, 5,6及8,9,10列分别为12个化合物浓度梯度，每个浓度梯度3个平行。
[0033] 所述毒性反应，即加样结束后进行混匀1000r/min速度震荡lmin，以使得96孔板 内体系均匀，然后将96孔板放入恒温震荡培养箱内，在温度为37°C，培养箱转速为180r/ min条件下培养12h。
[0034] 所述步骤（4)中的毒性表征，具体包括以下步骤：步骤（3)试样培养12h后取出， 用酶标仪检测其光密度值（〇D 62。)，化合物对枯草芽孢杆菌的毒性大小以化合物对枯草芽孢 杆菌吸收光〇D62。的抑制率进行表征，计算如下：
[0035] 抑制率（％) = [1_(样品 0D62。一空白 OD620V(对照 0D62。一空白 0D6J]x100 %式 (1)
[0036] 其中，对照0D62。指的是样品前后的空白0D62。的平均值。
[0037] 本发明所建立的方法为枯草芽孢杆菌毒性测试的基本方法，适用于各种污染物对 枯草芽孢杆菌的毒性作用测定。
[0038] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
[0039] 1.酶联免疫吸附实验由于操作简单，灵敏度高，特异性强等特点在环境领域已广 泛使用。酶标仪作为酶联免疫测定的常规仪器，测定原理基于物质物质吸收光谱及可见光 比色基础之上，操作简单、方便，减少实验操作中人为读数引起的误差，实验重复性好；样品 检测速度快，一次可检测多个样品，节省操作时间；实验结果直接储存于计算机中，实验数 据处理方便；
[0040] 2.使用96孔微孔板测定化合物对枯草芽孢杆菌的毒性，实用样品微量，节省实验 材料及实验试剂的用量，降低实验成本。同时，培养后直接测定，环境对样品干扰小，不易被 杂菌污染。
【附图说明】
[0041] 图1为本发明实施例的流程图。
[0042] 图2为本发明实施例96孔微孔板加样设置示意图。
[0043] 图3为邻苯二酚和间硝基苯酚对枯草芽孢杆菌的慢性毒性效应图。其中：（1)为 邻苯二酸对枯草芽孢杆菌的慢性毒性效应，EC 5。值为396mg/L(文献中采用分光光度计测定 结果为为437mg/L) ;(2)为间硝基苯酸对枯草芽孢杆菌的慢性毒性效应，EC5。值为440mg/ L (文献中采用紫外-可见分光光度计测定结果为430mg/L)。
[0044] 图4为应用所建立方法测定5种磺胺类抗生素对枯草芽孢杆菌的慢性毒性效 应结果图，其中：（1)为磺胺吡啶（SPY)对枯草芽孢杆菌的慢性毒性效应图，EC50值为 51.5nmol/L ；
[0045] (2)为磺胺氯哒嗪（SCP)对枯草芽孢杆菌的慢性毒性效应图，EC50值为6. 78nmol/ L ；
[0046] (3)为磺胺甲恶唑（SMX)对枯草芽孢杆菌的慢性毒性效应图，EC50值为57. 3nmol/ L ；
[0047] (4)为磺胺二甲异恶唑（SSZ)对枯草芽孢杆菌的慢性毒性效应图，EC50值为 9.57nmol/L ；
[0048] (5)为周效磺胺（SFD)对枯草芽孢杆菌的慢性毒性效应图，EC50值为33. lnmol/ L〇
【具体实施方式】
[0049] 以下结合实施例进一步说明本发明。
[0050] 实施例1
[0051] -种使用96孔微孔板测定枯草芽孢杆菌毒性的实验方法，其包括以下步骤（如图 1所示）：
[0052] (1)菌种复苏与传代，具体包括以下步骤：
[0053] 菌种复苏及传代在固体斜面培养基上进行；
[0054] 固体斜面培养基配方：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g，酵母提取物5. 0g，葡萄糖5. 0g，
[0055] NaC15. 0g，蒸馈水 1. 0L，琼脂 15. 0g
[0056] 固体培养基用lmol/L NaOH调pH至7. 0。
[0057] 将枯草芽孢杆菌冻干粉（购自中国科学院微生物所菌种保藏管理委员会）溶解， 接种到斜面上传代3次后获得稳定生长的菌株F 3，置于4°C冰箱保存备用；
[0058] (2)工作菌液培养及平衡，具体包括以下步骤：
[0059] (2a)工作菌液培养
[0060] 将传代至F3的菌株用接种环接种到5mL液体培养基中，在温度为37°C，培养箱转 速180r/min条件下培养6~8h，以作为毒性测试的工作菌液；
[0061] 液体培养基配方：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g，酵母提取物5. 0g，葡萄糖5. 0g，
[0062] NaC15. 0g，蒸馏水 1. 0L ;
[0063] 液体培养基用lmol/L NaOH调pH至7. 0。
[0064] (2b)工作菌液平衡
[0065] 按照十万分之一的稀释量移取步