一株解淀粉芽孢杆菌及其菌剂和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物病害生物防治领域，尤其涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其菌剂和应 用。
【背景技术】
[0002] 由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum)、腐皮镰刀菌（Fusarium solani)、烟草疫 霉菌（Phytophthora nicotianae)、青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum)等病原菌引 起的香蕉枯萎病、甜瓜枯萎病、番茄枯萎病、香草兰枯萎病、辣椒根腐病、番茄青枯病等植物 病害是一类毁灭性土传病害，目前对该类病害的防治还没有一种有效的化学农药，而且长 期使用化学农药对环境和人类健康造成严重威胁。生物防治是一项安全，环保的防治技术， 已成为研究热点。与化学防治法相比，利用拮抗菌防治植物病害具有对环境友好、成本低、 病原菌不易产生抗药性等优点，是未来病害防治的方向。尽管人们已经发现了大量拮抗细 菌，但目前所分离到的细菌还远不能满足农业生产发展的要求。
[0003] 解淀粉芽孢杆菌是一种芽孢杆菌，在其自身生长中可以产生一系列抗菌活性的代 谢产物。在众多生防菌中解淀粉芽孢杆菌抗菌谱广，能形成芽孢，抵御热、紫外线、电磁辐射 不良环境，广泛用于防治香蕉枯萎病、甜瓜枯萎病、番茄青枯病等土传病害。尽管解淀粉芽 孢杆菌已成为生物防治的研究热点，但是单一的生防芽孢杆菌及其制剂存在功能局限性， 同时前人报道了香蕉枯萎病的发生与发病程度分别取决于土壤和根际土壤中尖孢镰刀菌 数量。因此分离制备具有选择性拮抗活性的解淀粉芽孢杆菌菌株，用于研制生防菌复合制 剂，能够快速降低土壤中枯萎病等土传病原菌数量，对于有效控制香蕉等作物枯萎病的危 害，克服单一生防菌制剂防治土传病害田间防效不稳定的局限，具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一株解淀粉芽孢杆菌，解决现有技术中的解淀粉芽孢杆菌对生防菌和 病原菌不具有选择性拮抗的问题。
[0005] 本发明提供的一株解淀粉芽孢杆菌，拉丁名为Bacillus amyloliquefaciens，菌 株号为HC200,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为 CGMCC No. 10371。
[0006] 本发明的解淀粉芽孢杆菌在制备植物杀菌剂的应用。
[0007] 本发明还提供了一种杀菌剂，该杀菌剂由本发明的解淀粉芽孢杆菌制备而得，杀 菌剂包括解淀粉芽孢杆菌的菌体和代谢产物中的至少一种。
[0008] 本发明的杀菌剂用于防治由病原菌引起的植物病害，病原菌为尖孢镰刀菌、腐皮 镰刀菌、辣椒疫霉或青枯雷尔氏菌，植物病害为香蕉枯萎病、甜瓜枯萎病、番茄枯萎病、香草 兰枯萎病、辣椒根腐病或番茄青枯病。
[0009] 本发明还提供了复合杀菌剂，复合杀菌剂由绿色木霉H06和本发明的解淀粉芽孢 杆菌制备而得。
[0010] 复合杀菌剂包括本发明的解淀粉芽孢杆菌的菌体和代谢物的至少一种，还包括绿 色木霉H06的菌体和代谢物中的至少一种。
[0011] 复合杀菌剂用于防治由病原菌引起的植物病害，病原菌为尖孢镰刀菌、腐皮镰刀 菌、辣椒疫霉或青枯雷尔氏菌，植物病害为香蕉枯萎病、甜瓜枯萎病、番茄枯萎病、香草兰枯 萎病、辣椒根腐病或番前青枯病。
[0012] 本发明的解淀粉芽孢杆菌HC200CGMCC No. 10371在低浓度下能够有效抑制尖孢镰 刀菌、腐皮镰刀菌、烟草疫霉菌、青枯雷尔氏菌的生长，且杀菌应用范围广，对香蕉枯萎病、 甜瓜枯萎病、番茄枯萎病、辣椒枯萎病、番茄青枯病、辣椒根腐病等均具有防治效果。
[0013] 进一步地，由解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)HC200CGMCC No. 10371与绿色木霉H06混合制备而得的复合杀菌剂，对香蕉枯萎病、甜瓜枯萎病、番茄枯 萎病、香草兰枯萎病、辣椒根腐病、番茄青枯病的防治效果优于施用单一菌株解淀粉芽孢杆 菌HC200菌剂或绿色木霉H06菌剂，与绿色木霉H06具有良好的协同作用。
[0014] 菌种名称：解淀粉芽孢杆菌
[0015] 拉丁名：Bacillus amyloliquefaciens
[0016] 菌株编号：HC200
[0017] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0018] 保藏机构简称：CGMCC
[0019] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0020] 保藏日期：2015年01月19日
[0021] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No. 10371
【附图说明】
[0022] 图1-A为本发明实施例一的解淀粉芽孢杆菌HC200的菌落形态；
[0023] 图1-B为本发明实施例一的解淀粉芽孢杆菌HC200的芽孢形态；
[0024] 图2-A为本发明实施例三的解淀粉芽孢杆菌HC200对香蕉枯萎病菌的抑菌作用。 其中7为清水对照实验、1、2、3为多菌灵药剂对照实验，4、5、6为解淀粉芽孢杆菌HC200实 验；
[0025] 图2-B为本发明实施例三未加入由解淀粉芽孢杆菌HC200制备而得的杀菌剂时香 蕉枯萎病菌的菌丝形态；
[0026] 图2-C为本发明实施例三加入由解淀粉芽孢杆菌HC200制备而得的杀菌剂后香蕉 枯萎病菌的菌丝形态。
【具体实施方式】
[0027] 下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0028] 本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0029] 本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030] 本发明实施例所用NA培养液：牛肉浸膏3g/L，酵母浸膏lg/L，蛋白陈5g/L，葡萄 糖l〇g/L，用蒸馏水定容，其pH为7. 0。
[0031] 本发明实施例所用LB培养液：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L， 用蒸馏水定容。
[0032] 本发明实施例所用LB培养基是在上述LB培养液中加入琼脂得到的固体培养基。
[0033] 本发明实施例所用PDA培养液：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，是在上述PDA培养 液中加入琼脂得到的固体培养基。
[0034] 本发明实施例所用PDA培养基是在上述PDA培养液中加入琼脂得到的固体培养 基。
[0035] 本发明实施例所用枯萎病菌选择性培养基参照文献（景晓辉，吴伦英，区小玲， 朱利林，薛玉潇，吴琳，&黄俊生.一种简便分离香蕉枯萎病菌的选择性培养基.热带作 物学报? 2009,（11)，1671-1673.)。
[0036] 本发明实施例所用青枯雷尔氏菌选择性培养基参照文献（丁传雨.生物有机肥对 土传马铃薯青枯病的防控技术及机理研究[D].南京农业大学，2012.)。
[0037] 土壤中枯萎病菌/青枯病菌的检测方法采用稀释涂平板法，参照文献（李阜 棣，喻子牛，何绍江.农业微生物学实验技术[M].北京：中国农业出版社，1996:32-34， 305-306.)〇
[0038] 本发明实例中涉及到的香蕉枯萎病菌（即尖孢镰刀菌）、辣椒根腐病菌（即腐皮镰 刀菌）、烟草疫霉菌、番茄青枯病菌（即青枯雷尔氏菌）、枯草芽孢杆菌BSA-6、解淀粉芽孢杆 菌C10-1、解淀粉芽孢杆菌BWA7和绿色木霉H06均由中国热带农业科学院环境与植物保护 研究所提供，可由现有技术中的常规方法获得。
[0039] 枯草芽孢杆菌BSA-6的公开文献：潘江禹.枯草芽孢杆菌BSA-6防控香蕉枯萎病 初步研究[D]..海南大学.2013,海南海口。
[0040] 解淀粉芽孢杆菌C10-1的公开文献：曹红.香蕉枯萎病拮抗菌C10-1的鉴定及生 防潜力评价[D].华中农业大学.2013,湖北武汉。
[0041] 解淀粉芽孢杆菌bwa7的公开文献：薛玉箫.解淀粉芽孢杆菌bwa7在香蕉上的定 殖及其生防机制的初步研究[D].海南大学.2013,海南海口。
[0042] 绿色木霉H06的公开文献：黄俊生，梁昌聪，杨腊英，吴琳，王亚.一株绿色木 霉菌及其应用（ZL201210323738. 2);黄俊生，梁昌聪，刘磊，张建华，郭立佳，王伟伟.一种 液固双相发酵生产绿色木霉的方法（ZL201310372776. 1)。
[0043] 实施例一：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)HC200的分离及鉴定
[0044]1、解淀粉芽孢杆菌HC200的分离
[0045] 从中国海南省文昌红树林淤泥土壤采集土样样本，把土壤样本风干，过筛后称取 适量土样放入装有无菌水和玻璃珠的三角瓶中，充分振荡30min，待土样均匀分散后，静置 lOmin后，按梯度法稀至不同浓度，各梯度稀释液分别在80°C水浴加热20min后取一定量稀 释液涂布于壳聚糖选择性培养基上，在37°C恒温下培养2-4d，挑取单菌落纯化，作为待测 菌株。
[0046] 解淀粉芽孢杆菌的初筛：制备约1. 6X 105个/mL的香蕉枯萎病菌孢子悬浮液，吸 取3ml该孢子悬浮液涂布于自制的方形培养皿（22cmX 25cm)中的PDA固体培养基上，预 培养12h，用牙签均匀点待测菌接种于PDA固体培养基，并置于28°C的恒温培养箱下培养2 天，观察有无抑菌带。
[0047] 解淀粉芽孢杆菌复筛：取待测菌接种于PDA培养液，置于摇床37°C，150r/min，培 养24h，取2mL发酵液离心（10000r/min，离心8-15min)，取上清，经0. 22 ym微孔滤膜过滤， 取滤液。利用6mm打孔器在含有香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cubense)的 PDA固体培养基上打孔，分别加入待测菌滤液，培养2d后观察抑菌带透明度，计算抑菌带宽 度、重复3次，选择抑菌带宽度最大的目标菌株，即得到了解淀粉芽孢杆菌HC200。
[0048