一种表面氨基化聚苯乙烯微球的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于聚合物微球材料制备技术领域，具体涉及一种表面氨基化聚苯乙烯微球的制备方法。
【背景技术】
[0002]在生物学研究中，和在众多的应用领域，如诊断，生物技术，法医生物学，生物系统学中，DNA序列知识已成为不可缺少的知识。具有现代的DNA测序技术的快速测序速度已经有助于达到测序完整的DNA序列，或多种类型的基因组测序和生命物种，包括人类基因组和其他许多动物，植物和微生物物种的完整DNA序列。
[0003]近年来，测序技术不断改进，新方法相继问世，测序规模也不断扩大。测序技术的操作简单化、成本低廉化、以及高通量化成为测序技术的发展方向。SOLiD, 454以及Solexa等为代表的新一代高通量测序技术，以三国鼎立的姿态平分着序列测定的天下。三种技术各有千秋，发展更新的速度可谓日新月异。但目前而言，其测序文库制备的过程均仍较为复杂O
[0004]测序文库的制备作为整个测序过程中的第一个且及其重要的一个步骤，对测序结果的优劣有着决定性的作用。测序文库的制备大体来说包括以下几个步骤。第一步是如何将核酸从待检测的样本中高质量地提取出来。针对不同的样本，人们所选用的实验流程和方式将会有较大的差异；第二步是如何将长片段的核酸进行小片段花处理，主要针对基因组DNA及长片段的RNA等样本，因为目前测序仪对于读长的限制，只能对制备的随机小片段进行测序，再通过生物信息学方法进行拼接，得出全基因组的序列信息。目前核酸小片段化基本使用物理作用来进行，超声波由于其自身的各种优点而成为打碎DNA的普遍方式，可通过调节超声功率及超声时间来获得不同长度的小片段DNA。第三步便是如何将小片段核酸的两端连接上测序所需的通用接头序列；第四步是如何将连接有接头序列的核酸序列进行单分子多拷贝扩增，包括有乳液PCR、桥式PCR及滚环扩增等，在扩大测序信号强度的同时确保真实的反映样本的原始信息。而乳液PCR —般采用微球捕获一个模板DNA到一个小球，利用乳液PCR扩增单一模板，将同一模板在一个微球上扩增成上百万个模板克隆。
[0005]一般来讲，在乳液PCR中采用的微球为聚苯乙烯(PS)微球，并且在微球表面进行链霉亲和素修饰，从而使其可以捕获生物素标记的DNA分子。目前，合成单分散PS微球的方法有微乳液聚合法、乳液聚合法、分散聚合法、悬浮聚合法和种子聚合法等。但现有的合成方法都是交联剂和单体混合后再进行聚合，这种办法合成的聚合物微球聚合物是整体交联的，往往球形度差，粒径可控性低，因而通常需要分选才能达到粒径分布偏差小于5%的要求。为了合成得到交联的微球，却又不影响到微球的球形度和单分散性，日本专利JP58-106554和JP63-191818虽然提出了种子聚合的方法，即先通过乳液聚合获得种子，然后进行增长，扩大粒子。本方法的缺点是微球在生长过程中，产生次级粒子，需要筛分除去，造成产品收率降低，操作复杂，经济性差。因此，要得到粒径均一的微米级单分散具有交联的聚合物微球粒子是非常困难的。
[0006]由于用于核酸扩增的PS微球需要表面氨基化后才能和链霉亲和素交联，从而与标记有生物素的DNA模板连接，进而进行乳液PCR扩增。因此，制备氨基含量高的PS微球是至关重要的，目前，用聚合法制备氨基化聚苯乙烯微球时，均采用添加丙烯酸的方式向聚苯乙烯微球表面引入氨基。但采用这种方法制备出的氨基化聚苯乙烯微球大部分氨基被包埋在微球内部，聚苯乙烯微球表面的氨基分布比例不高。
【发明内容】
[0007]本发明的一个目的是一种表面氨基化聚苯乙烯微球的制备方法，包括以下步骤:
(1)将分散剂和苯乙烯单体加入介质中，通入氮气，搅拌；
(2)加热升温，加入引发剂，在恒温条件下持续搅拌，得到聚苯乙烯微球；
(3)取另一容器加入3-氨丙基三乙氧基硅烷和溶剂，涡旋震荡，加入制备的聚苯乙烯微球，通入氮气，加热于恒温反应，得到氨基化聚苯乙烯微球；
(4)取氨基化聚苯乙烯微球，加入乙磺酸缓冲液混合均匀后加入交联剂，搅拌，离心洗涤，去上清，沉淀经PBS重悬、振荡、超声处理后即得到活化的聚苯乙烯微球；取链霉亲和素溶于PBS缓冲液中，加入到经过活化的聚苯乙烯微球溶液中，离心，沉淀用PBS重复洗涤后的微球经超声分散重悬于PBS缓冲液中，加入赖氨酸，室温轻微震荡，离心洗涤；
(5)分别使用甲醇和水清洗微球，即得。
[0008]所述介质为甲醇和水。
[0009]所述引发剂为偶氮二异丁腈、过氧化乙酰和过氧化环己酮中的一种或几种，优选为偶氮二异丁腈和过氧化环己酮重量比为4:1。
[0010]所述交联剂为季戊四醇四丙烯酸酯和双季戊四醇六丙烯酸酯，体积比(5-6): 1，优选为6:1。
[0011]所述分散剂由聚乙烯基吡咯烷酮、烷基酚聚氧乙烯醚-10和聚乙二醇组成。
[0012]所述苯乙烯单体、分散剂、引发剂和介质的重量百分比依次为33-34%的苯乙烯单体，0.2-0.25%的分散剂，0.035%-0.045的引发剂，余量为介质。优选为34%的苯乙烯单体，
0.25%的分散剂，0.04%的引发剂，余量为介质。
[0013]所述溶剂由硝基苯和二氯甲烷组成，硝基苯和二氯甲烷的体积比为1:7。
[0014]所述加入制备的聚苯乙烯微球的量计为0.4-0.6g/ml 3_氨丙基三乙氧基硅烷。
[0015]所述搅拌的速度为150?180转/分钟。
[0016]本发明提供的方法条件温和、产率高，制备方法简单，适于大规模的推广应用。同时，本发明提高了氨基在聚苯乙烯微球表面的分布比例。交联剂季戊四醇四丙烯酸酯和双季戊四醇六丙烯酸酯的使用，使本发明制备的微球机械强度较大，易于回收。另外，通过对反应体系中的介质、引发剂和分散剂进行合理的优化，得到的微球粒径均匀，能够满足基因测序的需要。
【具体实施方式】
[0017]实施例1
(I)将0.3g聚乙烯基吡咯烷酮、1.2g烷基酚聚氧乙烯醚-10、1.625g聚乙二醇和425g苯乙稀单体加入400g水和421.375g乙二醇的混合物中，通入氮气，以150rpm/min搅拌25分钟；
(2)加热升温至70°C，加入0.4g偶氮二异丁腈和0.1g过氧化环己酮，在恒温条件下以180rpm/min持续搅拌10小时，得到聚苯乙稀微球；
(3)取另一容器加入20ml3-氨丙基三乙氧基硅烷和35ml溶剂(硝基苯和二氯甲烷的体积比为1:7)，涡旋震荡15分钟，加入制备的1g聚苯乙烯微球，通入氮气，加热于65°C恒温反应7小时，得到氨基化聚苯乙烯微球；
(4)取4.5mg氨基化聚苯乙烯微球，加入0.9ml乙磺酸缓冲液混合均匀后加入季戊四醇四丙稀酸酯和双季戊四醇六丙稀酸酯活化，160rpm/min搅拌15分钟，12000rpm/min离心洗涤，去上清，沉淀经PBS重悬、振荡、超声处理后即得到活化的聚苯乙烯微球；取链霉亲和素溶于PBS缓冲液中，加入到经过活化的聚苯乙烯微球溶液中，12000rpm/min离心，沉淀用PBS重复洗涤后的微球经超声分散重悬于PBS缓冲液中，加入赖氨酸，室温轻微震荡，离心洗涤；
(5)分别使用甲醇和水清洗微球，即得。
[0018]实施例2<