四溴双酚a人工免疫原tbbpa-bsa的制备及用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种四溴双酚A人工免疫原TBBPA-BSA的制备方法及用途，具体是 一种用于有机污染物四溴双酚A免疫检测的溴代阻燃剂一一四溴双酚A的人工免疫原 TBBPA-BSA的制备方法及用途。
【背景技术】
[0002] 溴代阻燃剂（BrominatedFlameRetardant，BFRs)是指能使聚合物不容易着火或 者着火后使其燃烧变慢的一种助剂。溴代阻燃剂是目前世界上产量和用量最大的有机阻燃 剂之一。其中，四溴双酚A(简称TBBA或TBBPA或TBA)是目前我国有机溴代阻燃剂主要产 品，也是世界上用量第二大的溴代阻燃剂，它主要是由双酚A溴化所得。全球四溴双酚A的 产量从1994年的0. 64万吨增加到2012年的2万吨，并在电子产品、纺织品、建筑装潢材料 等各种制造业产品和材料中广泛使用；此外，随着这些产品的使用，TBBPA可以慢慢逸散到 环境中。
[0003]国内外广大环境学者对各种环境介质和生物样品中TBBPA的浓度和毒性效应 做了大量研究。研究表明，TBBPA可以在各种水体、底泥、土壤、大气等各种环境介质中存 在，并可以随气溶胶远距离迀移。在不同营养级生物体内含量变化表现出明显的生物富 集性，并对生物体有毒性和内分泌干扰性。TBBPA的污染能力有很高的持久性，主要危害 有三点：首先，长期接触会妨碍大脑和骨骼发育；其次，被焚化处理时，会释放出有高致癌 性的溴化二恶英和呋喃。因此，研究认为TBBPA是潜在的具有持久性、生物累积性和毒性 (PBT-persistent bioaccumulative toxie)的化合物。早在2003年，TBBPA就已经引起世 界绿色和平组织的重视。欧盟关于环保的"2个指令"起初计划限制所有溴代阻燃剂的使 用，并设想以磷、氮替代，但因氮、磷资源缺乏，个别性能远不能满足需求以及可能造成水体 的富营养化的潜在风险，而未将TBBPA纳入。目前，TBBPA已作为危害物质被列入《东北大 西洋海洋环境保护条例》0SPAR的名录中。
[0004]目前，关于TBBPA的研究主要集中在水体、沉积物、大气等环境领域和生物体的毒 性方面，但样品的检测方法方面研究较少。目前对四溴双酚A的检测手段主要为气相色谱 和高效液相色谱等仪器检测方法，这些方法虽然准确可靠，但对样品的预处理方法和操作 人员的专业性有很高的要求。正因为这些方法的处理复杂、耗时、仪器价格昂贵而不适合推 广使用，也不利于在环境污染事故现场快速检测。为克服这些缺点，寻求一种快速、简便、灵 敏且经济实用的分析方法就成为环境监测领域的主要研究方向。因此，开展研究并建立有 效、可靠的含溴阻燃剂的检测方法及标准，并通过相关的法规予以保障，成为一项极为重要 和迫切的工作。
[0005] 20世纪60年代发展起来的免疫分析（Immunoassay,IA)是基于抗原和抗体的特异 性、可逆性结合反应的分析技术。免疫分析具有常规理化分析技术无可比拟的选择性和高 灵敏性，非常适合复杂介质中痕量组分的分析。因此免疫分析具有的特异性强、灵敏度高、 方法快捷简单、分析通量大、检测成本低等优点，使得该类方法可以满足简单、快速、灵敏地 检测持久性有机污染物的要求。1985年美国Cetus公司的K.B.Mullis和R.K.Saiki等发 明了一种特异性DNA体外扩增技术，成为PolymeraseChainReaction，简称PCR，即聚合酶 链式反应。1992年Sano等将免疫分析技术与PCR技术结合，发展出荧光免疫PCR技术。荧 光免疫PCR技术兼具了免疫分析的特异性强和PCR技术的灵敏度高（检测限高达10 11~ 10 12g/L)的特点，可用于检测环境中痕量污染物。
[0006] 目前，尚无用荧光免疫PCR技术检测TBBPA的相关报道。而制备合格的TBBPA抗 原是生物免疫得到高特异性抗TBBPA抗体的前提，更是建立TBBPA免疫检测分析方法的关 键，这将具有重要的应用价值和理论研究意义。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是首次提供一种步骤简单，速度快，产率高 的四溴双酚A人工免疫原TBBPA-BSA制备方法，为免疫得到特异性抗体和利用人工抗原、抗 体建立免疫检测方法奠定基础。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0009] 本发明提供了 一种四溴双酚A人工免疫原TBBPA-BSA，结构如式I所示：
[0010]
[0011] 其中BSA为牛血清蛋白。
[0012] 本发明还提供了一种四溴双酚A人工免疫原TBBPA-BSA的制备方法，包括以下步 骤：
[0013]TBBPA半抗JI
与载体蛋白BSA偶联制备TBBPA-BSA。
[0014] 优选地，所述TBBPA半抗原通过TBBPA与溴乙酸在碱性环境中反应制备得到。所 述TBBPA半抗原化学名称为3_(2, 6_二漠_4-(2-(3, 5_二漠_4_轻苯基）丙烷_2_基）） 丙酸，分子量为601. 92。
[0015] 优选地，所述TBBPA半抗原的制备包括以下步骤：
[0016] A1、将TBBPA和碱金属氢氧化物溶解在非质子性有机溶剂中，得溶液A，逐渐升温；
[0017]A2、将溶解于非质子性有机溶剂的溴乙酸逐滴加入到步骤A1中升温后的溶液A 中，随后保持恒温回流反应，直至原料点消失为止。
[0018] 优选地，所述的TBBPA、碱金属氢氧化物和溴乙酸的摩尔比为1:2~4:1~2 ;所述 步骤A2中溶液A的温度为80~85°C，恒温回流反应时间为4~6小时。
[0019] 优选地，所述反应时间为4~6小时，反应温度为80~85°C。
[0020] 优选地，所述TBBPA半抗原与载体蛋白BSA偶联制备TBBPA-BSA的方法包括以下 步骤：
[0021] B、将溶有N-羟基琥珀酰亚胺和N，N' -二环己基碳酰亚胺的有机溶剂A逐滴加入 溶有TBBPA半抗原的有机溶剂B中，搅拌反应，过夜，离心分离上清液；
[0022] C、将上清液加入到溶有牛血清蛋白BSA的磷酸盐缓冲液中反应；
[0023] D、反应结束后，将溶液装入透析袋透析；透析后离心分离上清液，即得TBBPA人工 免疫原TBBPA-BSA。
[0024] 本发明采用活化酯法合成四溴双酚A人工免疫原，其反应方程式如下：
[0025]
[0026] 优选地，所述的有机溶剂A和B独立的选自非质子性有机溶剂，具体包括N，N' -二 甲基甲酰胺或二甲基亚砜。
[0027] 优选地，所述的TBBPA半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺、N，N' -二环己基碳酰亚胺、BSA 摩尔比为1:1~3:1~3:0. 005~0. 05。经过碳二亚胺缩合反应，蛋白质分子中的游离羧 基能与半抗原分子中的氨基形成较为稳定的酰胺键，该反应条件比较温和，应用范围广。理 想状态下，半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺、N，N' -二环己基碳酰亚胺反应的摩尔比是1:1: 1， 为了充分快速反应，最多将摩尔比例调为1:3:3。
[0028] 优选地，所述步骤B中搅拌反应时间为6~12小时。为充分反应，当半抗原与N-羟 基琥珀酰亚胺、N，N'-二环己基碳酰亚胺反应的摩尔比是1:3:3时搅拌反应6小时就可以， 当半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺、N，N'-二环己基碳酰亚胺反应的摩尔比是1:1:1时且搅拌 速度稍慢的时候需反应12小时。
[0029] 优选地，所述步骤C的反应时间为2~6小时，反应温度为0~4°C。当蛋白较少 时2小时就可以，当蛋白量加入较多的时候就反应6小时才能反应完全。该反应为低温反 应，蛋白质最适宜保存温度是〇~4度。0度以下结冰无法反应；温度过高，则将导致蛋白 质失效。
[0030] 全抗原的表征：
[0031] 将制备的全抗原适当稀释，使其吸光度在0. 1-2之间，以PBS为空白对照，用紫外 分光光度计在200~500nm分别测定TBBPA半抗原和TPPBA-BSA吸光值，绘制紫外吸收光 谱图，并根据以下公式计算偶联比：
[0032]
[0033]式中：〇DCC]_gate偶联物吸光度；〇Dprotein蛋白质吸光值；〇Dhapten半 抗原吸光值；Chapten--半抗原浓度；