一种肺炎链球菌蛋白抗原及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和免疫学领域。具体地，本发明涉及一种在多种血清型肺 炎链球菌中高度保守的、减毒的、具有良好免疫原性的、接受免疫后能对肺炎链球菌侵袭提 供良好保护的蛋白，还公开了其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 1、肺炎链球菌的相关情况
[0003] 早在1881年美国Sternberg和法国的Pasteur各自分离到了肺炎链球菌 (Streptococcuspneumoniae)，1886年Weichselbaum证明它能引起肺炎等疾病，是人类重 要的病原菌。在磺胺药和抗生素问世前，肺炎链球菌感染的发病率和病死率都非常高，所以 一直是人们广泛关注的研究课题。
[0004] 肺炎链球菌是革兰氏阳性双球菌，菌体呈矛尖状，一般呈单个或成对排列，宽端相 对，有时有短链，无鞭毛，不产生芽孢，有荚膜，菌体细胞直径0. 5-1. 25ym。初分离的菌种有 较厚的荚膜，不同型别的菌种荚膜厚度有区别。幼龄菌体革兰氏阳性反应十分典型，随着培 养时间的延长，菌体老化，革兰氏染色着色不一，最终呈阴性反应。
[0005] 肺炎链球菌的荚膜不仅是其毒力的必需条件，而且荚膜多糖有群/型特异性，是 分群/型的基础。1902年Neufeld发现肺炎链球菌抗血清能使同型肺炎链球菌荚膜发生肿 胀，建立了荚膜肿胀反应（quellungreaction)。这个实验至今仍是肺炎链球菌分群/型的 唯一的和经典的方法。1944年美国的Eddy用荚膜肿胀实验根据分离和鉴定菌种的顺序， 以连续数字命名血清型。1957年，丹麦学者Lund把具有交叉反应的血清型归在一个"群" 里，以数字表示"群"，在各"群"的数字之后以大写字母表示"型"。世界卫生组织推荐采用 丹麦分型法，目前肺炎链球菌的各类疫苗的血清型别也都用丹麦分型法来命名。采用丹麦 分型法进行分类，迄今为止肺炎链球菌已分为46个群，90个型。
[0006] 肺炎链球菌对营养要求高，在普通营养琼脂斜面和普通营养肉汤中不生长，必须 加全血、血清或腹水促进生长。该菌为兼性厌氧菌，在5-10%的0) 2环境中生长更好，特别 是最初分离菌种在C02环境中存活率高。
[0007] 当人体健康、免疫功能正常时，肺炎链球菌是寄居在人类口腔和鼻咽腔的正常菌 群之一，婴儿在出生后不久就开始有肺炎链球菌的寄居。一般带菌率随年龄、季节、免疫状 态的不同而不同，约6 % -60 %。当人的机体受到损伤时有毒力的肺炎链球菌就会侵入人体 引起疾病。
[0008] 肺炎链球菌主要引起肺炎、脑膜炎、中耳炎和败血症等人类常见传染病。各个年龄 阶段都会被感染，老人和儿童是感染的高危人群。
[0009] 虽然肺炎链球菌引起的疾病至今仍在全球广泛传播，但其准确的发病率并不十分 确定。因为肺炎链球菌是人类鼻咽部正常菌群之一，从痰中分离的该菌有可能是带菌污染 所致，因此不能作为确定上呼吸道及下呼吸道疾病病原菌的依据。从血液或脑脊液等标本 培养分离所得到的肺炎链球菌虽然能作为病原菌的可靠依据，但这类标本培养的阳性率往 往又受抗生素治疗的干扰，抗生素抑制了细菌的生长使培养阳性率很低，不能如实反映病 原菌的情况，也造成了发病率统计的不准确。目前所提供的数据和资料主要通过回顾性研 究和不同调查报告估计而来，这些估计往往使发病率偏低。
[0010] 美国CDC报道，在美国，肺炎链球菌感染是社区获得性肺炎最常见的病因，还是细 菌性脑膜炎的第二位重要病因。据估计，美国每年发生肺炎链球菌性肺炎150000-570000 例，肺炎链球菌性脑膜炎2600-6200例，并造成死亡40000例。据Austrian统计，在美国， 因患该病所导致的缺勤和住院，每年损失约4. 2亿美元。
[0011] 1939年和1940年磺胺类药物和青霉素相继问世，对肺炎链球菌感染有明显疗效， 使肺炎链球菌疾病的病死率大幅度下降，对疾病的流行和危害人们健康的严重程度有了控 制和缓解。对抗生素治疗的极大兴趣使人们一度放弃了对菌苗的研究。但是，在使用抗菌 药物治疗的过程中，人们逐渐发现在发病的前5天并不能降低病死率，这是由于一部分患 者在感染初期就受到了肺炎链球菌所造成的生理上的不可逆的损伤，而抗生素不能治疗这 种损伤，这些病人最易死亡。其次人们还发现青霉素的治疗不能全部杀死肺炎链球菌，患者 症状虽然减轻或者消失了，但从病人血液或痰中仍能分离到肺炎链球菌，说明疾病并未根 除。此外，长期使用抗生素还导致耐药菌株的出现，而且耐药率逐渐升高，由耐药菌株引起 的疾病的肺炎临床症状不典型，从而出现了"难治性"肺炎。而且使用抗生素后仍造成患者 特别是老年人的高病死率，如在美国虽有抗生素治疗，肺炎链球菌性菌血症的病死率仍高 达25% -30%。这一切都告诫人们，仅用抗生素治疗和控制肺炎链球菌疾病不能达到满意 的效果，再度使人们认识到研究肺炎链球菌疫苗的重要性。
[0012] 2、肺炎链球菌疫苗的发展、现状和不足
[0013] (1)肺炎链球菌荚膜多糖疫苗
[0014] 1927年发现给小鼠注射肺炎链球菌荚膜多糖和灭活的全菌疫苗同样得到免疫保 护。1930年报道了肺炎链球菌荚膜多糖对人的免疫原性，不同型别的荚膜多糖的免疫原性 是独立的，互相没有干扰和交叉免疫反应，因此，单一型别的荚膜多糖疫苗不能阻止其它型 别肺炎链球菌的感染。
[0015] 1983年23价肺炎链球菌多糖疫苗研制成功并投放市场，根据WHO规程确定，制 造疫苗的型别为 1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、 22F、23F和33F，即23价疫苗；每人份疫苗中含有每种多糖25微克，共575微克。这23个 血清型对美国、法国、中国等常见血清型的覆盖率均在85%以上，可作为全球普遍使用的疫 苗。美国于1983年批准使用了该疫苗。2006年10月21日，第一批疫苗制品正式获准上市 (商品名：惠益康）。成都生物制品研究所成为国内首家，也是继美国默沙东和法国巴斯德 之后世界第三家获准生产该疫苗的厂家。
[0016]缺点：肺炎链球菌多糖是非T细胞依赖性抗原，用其制备的菌苗免疫一针可诱导 机体产生保护水平的抗体，但再次免疫不能使已经降低的抗体恢复到初次免疫后的水平， 不能诱导免疫记忆；另外，肺炎链球菌多糖疫苗对2岁以下的婴幼儿免疫效果不理想。其主 要原因是2岁以下儿童的B细胞免疫系统发育不成熟，对多糖抗原的免疫应答较低，仅能产 生短暂的IgM抗体，难以达到良好的保护效果。
[0017] (2)蛋白一多糖结合疫苗
[0018] 美国惠氏公司研制的7价肺炎链球菌结合疫苗一一"沛儿" (PCV-7)(包括血清型 4、6B、9V、14、18C、19F、23F)已于2000年通过FDA批准上市。2008年5月13日获得我国 国家食品药品监督管理局（SFDA)批准在中国上市。该疫苗是目前全球惟一用于预防两岁 以下婴幼儿侵袭性肺炎链球菌疾病的疫苗。美国从2000年开始对所有新出生的婴儿实施 PCV-7常规接种，3年内使得这7种肺炎球菌血清（株）引起的儿童肺炎链球菌疾病下降了 94%。临床试验表明，PCV-7具有良好的耐受性，可以与其他常规儿童疫苗同时接种。
[0019] 但是，结合疫苗也存在一些问题，主要是单一蛋白不能对多种肺炎链球菌多糖提 供足够的载体效应，以及7价之外的其他血清型引起的疾病逐渐增加。另外，结合疫苗制备 过程复杂、成本高。
[0020] 为了解决上述问题，同时为了做到肺炎链球菌疫苗对多种血清型肺炎链球菌的广 谱保护，人们提出了使用多种血清型肺炎链球菌中保守蛋白质作为疫苗组分构建蛋白疫苗 的新设计。
[0021]3、肺炎链球菌溶血素
[0022] 肺炎链球菌溶血素（Pneumolysin,Ply)是一种多功能的毒力因子，是所有肺炎链 球菌临床分离株都含有的一种分子量为53kDa的蛋白，在肺炎链球菌感染的早期具有增强 该菌毒力的多种功能。
[0023]Ply能损伤上皮组织，破坏呼吸道机械屏障，能损害近端下呼吸道的纤毛清除机 制，促进肺炎链球菌对上呼吸道的粘附和进入下呼吸道，还能损伤下呼吸道中的肺泡-毛 细血管屏障，直接造成肺泡充血，为细菌提供营养，加速细菌在肺泡中的增殖。Ply有降低多 形核白细胞产生过氧化氢等杀菌物质的能力，从而抑制多形核白细胞的杀菌活性。此外，体 内的淋巴细胞在触发时其质膜的脂质处于流体状态，淋巴细胞膜上的胆固醇在维持脂质的 流动性方面起重要作用。Ply能与胆固醇结合，从而抑制淋巴细胞的触发和增殖。Ply还有 抑制淋巴细胞产生淋巴因子和IgA、IgG和IgM等作用。总之，Ply通过破坏组织屏障及改 变宿主免疫应答的平衡，使肺炎链球菌在人体内不断增殖和扩散，造成严重疾病。
[0024]人体能产生对Ply的抗体。注射了灭活的肺炎链球菌溶血素或重组的肺炎链球菌 溶血素类毒素的小鼠，当受到肺炎链球菌攻击时能提高存活率。因此，Ply本身是一种有潜 力的候选疫苗组分，机体能产生Ply抗体从而诱导特异性抗肺炎链球菌免疫，更重要的是 它也可能成为制备结合疫苗的有效载体。
[0025] 需要注意的是，Ply本身是肺炎链球菌的毒力蛋白，需要减毒后才能用作疫苗组 分。本发明在Ply序列的基础上，突变了两个氨基酸进行减毒，使之毒性降低的同时依然能 诱导出有效的足够滴度的抗体，从而可作为疫苗组分用于肺炎链球菌的预防和治疗。
【发明内容】
[0026] 在第一方面，本发明提供了一种具有两个点突变的肺炎链球菌溶血素减毒突变体 (在下文中简称？1712)，其氨基酸序列如5￡〇10勵:2所示。
[0027] 本发明的PlyM2在大肠杆菌中表达量大，纯化步骤简便易行。申请人通过实