从杜仲叶中提取京尼平的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域的提取方法，具体说是从杜仲叶中提取京尼平的方法。
【背景技术】
[0002]杜仲(学名Eucommia ulmoides Oliver)，又名胶木，为杜仲科植物。杜仲游离氨基酸极少，含有的少量蛋白质，是和绝大多数食品类似的完全蛋白，即能够水解检出对人体必需的8种氨基酸。测定了杜仲所含的15种矿物元素，其中有锌、铜、铁等微量元素，及钙、磷、钾、镁等宏量元素。药用杜仲，即为杜仲科植物杜仲的干燥树皮，是中国名贵滋补药材。其味甘，性温。有补益肝肾、强筋壮骨、调理冲任、固经安胎的功效。可治疗肾阳虚引起的腰腿痛或酸软无力，肝气虚引起的胞胎不固，阴囊湿痒等症。在《神农本草经》中被列为上品。现代研究杜仲具有清除体内垃圾，加强人体细胞物质代谢，防止肌肉骨骼老化，平衡人体血压，分解体内胆固醇，降低体内脂肪，恢复血管弹性，利尿清热，广谱抗菌，兴奋中枢神经，提高白血球药理作用。
[0003]京尼平(Genipin)由京尼平甙分解后分离提纯而获得，其主要用途有:京尼平可与氨基酸或者蛋白质反应，生成一种桅子蓝色素，这种天然色素因其无毒性而被用于食品染料的制作；优良的天然生物交联剂:可以与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖等交联制作生物材料，如人造骨骼、伤口包扎材料等，其毒性远低于戊二醛和其他常用化学交联剂；可用于治疗肝脏疾病、降压、通便等。以色列一家医疗中心的研究结果表明，京尼平可以缓解II型糖尿病的症状；制备固定化酶的交联剂；是迄今发现的环烯醚萜甙中抑制诱变剂诱变活性最强的物质；也有文献报道京尼平具有抗血栓抑制细胞凋亡的作用；总的来说，京尼平应用广泛，具有开发潜力，广阔的市场前景和巨大的利用价值。
[0004]京尼平甙主要存在于桅子、杜仲等天然植物中，是提取京尼平甙的理想原料，国内现有提取工艺方案中存在着提取率不高、产品纯度低、能源消耗大、大量使用有机溶剂、废水量大等问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供从杜仲叶中提取京尼平的方法，具有工艺简单，适合生产，生产成本低等优点。
[0006]本发明通过以下技术方案实现，具体包括如下步骤:
[0007]I)预湿堆放:将杜仲叶在阴凉处建堆，喷水，待水从堆底部流出后，自然堆放；
[0008]2)原料处理:将步骤I)得到的杜仲叶粉碎或破碎，加入相当于原料2-3倍重量的纯净水，加热至50_60°C维持5-10分钟，得到膏状浆液；
[0009]3)第一次酶解:将步骤2)得到的膏状浆液，调pH为4-5，加入膏状浆液
0.05-0.1 %重量份的果胶-纤维素复合酶和0.001重量份的甘露醇进行酶解40-60分钟，得到第一次酶解液；
[0010]4)去油:将步骤3)得到的第一次酶解液，加入2-3倍重量的纯净水，加热至60-70°C浸提60-120分钟，得上层浮油液与下层液、渣混合物，分离；
[0011]5)第二次酶解:将步骤4)得到的下层液、渣混合物，调pH为4.5，加入相当于混合物0.1-0.2%重量份的纤维素酶进行酶解40-60分钟，得到第二次酶解液，重复两次；
[0012]6)柱层析:合并第二次酶解液，过滤，浓缩，通过柱层析，用大孔吸附树脂进行吸附，用去离子水清洗树脂至流出液体为无色，再用浓度为15-20%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；
[0013]7)第三次酶解:将步骤6)得到的洗脱液，调pH为4.5，加入β -葡萄糖苷酶进行酶解，酶的用量为洗脱液重量的5-10%，酶的浓度为lmg/ml，酶解温度为50_60°C ；
[0014]8)柱层析:将步骤7)得到酶解液，通过柱层析，用大孔树脂进行吸附，用去离子水清洗树脂至流出液体为无色，再用浓度为10-20%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；
[0015]9)干燥:将步骤8)得到的洗脱液浓缩，再通过干燥得到粉末状京尼平。
[0016]本发明步骤I)所述的预湿的堆放，优选6-12小时。
[0017]步骤3)所述的果胶-纤维素复合酶，优选活性是1-3万活性单位/克(毫升)的固态或液态果胶-纤维复合酶。
[0018]步骤6)和步骤8)所述的大孔吸附树脂型号优选DlOl型、DA201型。
[0019]与现有技术相比，本发明的优点:
[0020]1、杜仲叶的植物细胞内含有大量的油脂，主要由成分为甘油三酯的化合物组成的混合物，这些油脂以油粒和油体原生质体形式、呈不连续颗粒状、与颗粒蛋白体一起无规则地分散在细胞内等存在形式存在。现有的提取方法，都是直接对杜仲叶等原料打碎或粉碎后通过水提/醇提、酶解、或者微波提取等方式直接提取，在提取的时候，细胞中的油脂会同时分离出，含有油脂的基团和京尼平甙、京尼平甙酸、色素等成分混在一起，从而影响后续有效成分的分离，增加了工序的处理难度。本发明先采用酶提取植物油脂，利用非油成分对油和水的亲和力差异及油水比重不同而将油和非油成分分离，增加了产品收率和提高了提取率。
[0021]2、本发明采用杜仲叶预湿堆放，加适量水，建堆发酵，随着发酵过程温度的上升，杜仲叶逐渐软化，水分自然进入到内部，利于植物油脂的分离，利于后续酶解、去油。
[0022]3、本发明先采用果胶-纤维素复合酶去除细胞壁，释放植物细胞中的油脂，加入甘露醇，可以保持渗透压，利于油脂的释放。
[0023]4、采用本发明的方法，京尼平甙转化率高，在75%以上。
【具体实施方式】
[0024]下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
[0025]实施例1:
[0026]从杜仲叶中提取京尼平的方法，具体包括如下步骤:
[0027]I)预湿堆放:将杜仲叶在阴凉处建堆，喷水，待水从堆底部流出后，自然堆放12小时；
[0028]2)原料处理:将步骤I)得到的杜仲叶粉碎，加入相当于原料2-3倍重量的纯净水，加热至50°C维持5分钟，得到膏状浆液；
[0029]3)第一次酶解:将步骤2)得到的膏状浆液，调pH为4，加入膏状浆液0.05%重量份活性是I万活性单位/克的果胶-纤维素复合酶和0.0Ol重量份的甘露醇进行酶解40分钟，得到第一次酶解液；
[0030]4)去油:将步骤3)得到的第一次酶解液，加入2倍重量的纯净水，加热至60°C浸提120分钟，得上层浮油液与下层液、渣混合物，分离；
[0031]5)第二次酶解:将步骤4)得到的下层液、渣混合物，调pH为4.5，加入相当于混合物0.1 %重量份的纤维素酶进行酶解60分钟，得到第二次酶解液，重复两次；
[0032]6)柱层析:合并第二次酶解液，过滤，浓缩，通过柱层析，用DlOl型大孔吸附树脂进行吸附，用去离子水清洗树脂至流出液体为无色，再用浓度为20%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；
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