一种对由生物法合成的(r)-(-)-扁桃酸进行分离纯化的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程技术领域，涉及一种对由生物法合成的(R)-(-)-扁桃酸进行分离纯化的方法。
【背景技术】
[0002]扁桃酸是极其重要的手性药物中间体，具有消炎和杀菌的双重作用。目前，在国际市场上，对扁桃酸的需求约以年均10%左右的速度增长，尤其是(R) - ( _)-扁桃酸早已成为国内外急需的产品。
[0003](R)-(-)-扁桃酸及其衍生物是合成环扁桃酯、羟苄唑、匹莫林等血管扩张剂、杀菌剂、镇痉剂的重要药物中间体，且具有很好的生物分解性，是目前最受瞩目的酸性光学拆分剂，可使多数外消旋体胺类和氨基酸类经非对映体异构盐形成法进行光学拆分，如止咳药甲吗南的中间体八氢异喳琳衍生物可由(R) - (_)-扁桃酸拆分。
[0004]目前，常见的制备扁桃酸旋光性单体的方法大致有:(I)物理化学法，其中包括不对称合成法、光学异构体拆分法和层析法等，不对称合成法可直接化学合成扁桃酸的异构体，拆分法先合成外消旋体扁桃酸，再拆分获得手性扁桃酸；(2)生物合成法。
[0005]申请号为201510334809.2的专利提出了一种生物法合成(R)-(-)-扁桃酸的方法以取代传统的化学拆分法。该方法单批次反应(R)-(-)-扁桃酸的累积浓度达到2.9M，ee值大于97%。为了使该方法生产出的(R) - ( _ )-扁桃酸更容易达到产业化生产，有必要开发一种能够简便并且廉价地将(R)-(-)-扁桃酸从终产物混合物中进行分离并纯化的方法。
【发明内容】
[0006]本发明的主要目的在于提供一种对由生物法合成的(R)-(-)-扁桃酸进行分离纯化的方法，该方法具有操作简便、分离效果好、成本低和周期短等优点。
[0007]为达到上述目的，本发明的解决方案是:
[0008]—种对由生物法合成的(R)-(-)-扁桃酸进行分离纯化的方法，其包括如下步骤:
[0009](I)、将扁桃腈流加入含有用于分泌J2315腈水解酶的E.coli工程菌的转化液中，在pH为6.0 - 9.0和温度为20 - 400C的条件下反应20 - 24h，停止流加并继续反应2 - 6h，得到反应液；
[0010](2)、对步骤(I)所得反应液进行前处理以去除不溶物，得到处理液；
[0011](3)、对步骤(2)所得处理液进行酸化处理，可以在20 - 30°C的温度下收集析出的晶体并得到酸化液；
[0012](4)、对步骤(3)所得酸化液进行浓缩处理和结晶处理，收集析出的晶体；
[0013](5)、合并步骤(3)和步骤(4)所得晶体，进行精制处理后得到(R)-(-)-扁桃酸。
[0014]其中，步骤⑴所涉及的方法与申请号为201510334809.2的中国专利所用的方法相同。
[0015]在步骤⑴中，将扁桃腈以第一流加速度流加10 - 12h，在剩余的反应时间内以第二流加速度进行流加，第一流加速度大于第二流加速度，优选为第一流加速度是第二流加速度的2倍。
[0016]在步骤⑴中，第一流加速度可以为10 -^gL-1IT1,第二流加速度可以为5 - 20gL_1h_1;优选地，第一流加速度可以为15 - 35gL _1h_1，第二流加速度可以为
7.5 - 17.5gL - - S更优选地，第一流加速度可以为20 - 30gL _ V、第二流加速度可以为10 - 15gL_ 1IT1;最优选地，第一流加速度为24gL _ 1Ii _ \第二流加速度为12gL_1h_1。
[0017]在步骤(I)中，pH可以为7-8.5，还可以优选为7.9-8.1 ;温度可以为25 -37°C，还可以优选为30 °C。
[0018]在步骤(I)中，转化液的制备方法包括如下步骤:
[0019]a、将E.coli工程菌在发酵培养基中进行扩增培养并诱导表达，离心以得到静息细胞；
[0020]b、收集静息细胞，并将其悬浮在pH为6.0 - 9.0的缓冲液中，得到转化液。
[0021]其中，在步骤a中，发酵培养基的组分及含量如下:酵母膏16 -eOgl/1、蛋白胨12-80gL_1、甘油 1- 500mlL"\ K2HPO4 24.75gL"\ KH2PO4 3.47gL"\ MgSO4 IgIZ10
[0022]在步骤b的转化液中，静息细胞的浓度可以大于1gL'优选为10 -1OOgL'进一步优选为10 - 50gL_1，最优选为10 - 20gL_1o
[0023]在步骤b中，缓冲液可以为NaH2P04/Na2HP0#l冲液、KH 2Ρ04/Κ2ΕΡ0Μ冲液中和Tris - HCl缓冲液的任意一种。缓冲液的浓度可以为20 - 200mM。
[0024]在步骤b中，转化液还可以含有助溶剂，助溶剂为体积分数为1- 25%的甲醇、乙醇、异丙醇和正己烷中的任意一种或几种，优选为体积分数为5 - 10%的甲醇、乙醇、异丙醇和正己烷中的任意一种或几种。
[0025]在步骤(2)中，前处理步骤可以为过滤、吸附、旋转蒸发、离心和萃取中的任意一种或几种。过滤可以采用硅藻土过滤；吸附可以采用活性炭吸附。
[0026]在步骤(3)中，酸化处理可以为使用酸将处理液的pH值调至1- 7，优选为调至1-5，更优选为调至2-4。酸可以为盐酸、磷酸和醋酸中的任意一种或几种。酸的添加体积与处理液的体积之比可以为5% - 30%，优选为10% - 15%。
[0027]在步骤(3)中，晶体的收集方式为过滤收集或离心收集，优选为真空抽滤收集。
[0028]在步骤(4)中，浓缩处理为在55 -1OOtC的温度下采用旋转蒸发将酸化液的体积浓缩至10 - 60%，优选为浓缩至20 - 40%。浓缩处理也可以优选为在65 - 85°C的条件下进行，更优选在75°C的条件下进行。旋转蒸发的次数可以为1- 5次，还可以优选为2 - 3次。
[0029]在步骤(4)中，在浓缩处理完毕后继续进行结晶处理。结晶处理为将经过浓缩处理后的酸化液的温度(即结晶温度)降至O - 50°C，优选为降至10 - 30°C，更优选为降至20 - 30°C。当温度降至50°C以下后，处于过饱和状态的扁桃酸便会结晶析出。
[0030]在步骤(5)中，精制处理包括如下步骤:将步骤(5)所得的合并后的晶体在50 -100°C烘干，采用溶剂溶解，并继续进行步骤(4)的浓缩处理和结晶处理2?3次，收集析出的晶体，继续在50 - 100°C下烘干12h，得到(R)-(-)-扁桃酸。
[0031]在步骤(5)中，烘干温度可以为70 - 80°C。溶剂可以为水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、甲苯、二氯甲烷和正己烷中的任意一种。
[0032]由于采用上述方案，本发明的有益效果是:
[0033]本发明对由生物法合成的(R) - (_)-扁桃酸进行了一系列处理，从而实现对终产物混合物中的(R)-(-)-扁桃酸的分离纯化。
[0034]首先，本发明的方法特别针对通过生物法合成的(R)-(-)-扁桃酸的分离，其操作步骤较少，因此操作简单、分离纯化的周期较短，生产效率较高。
[0035]其次，本发明的方法的各个操作步骤不需要大型的仪器设备即可完成，反应条件比较温和，能耗较低，若投入工业化应用无需前期较大的成本投入，有利于由生物法合成的(R)-(-)-扁桃酸的后继产业化生产。
[0036]最后，本发明的方法分离效果好。经过测试证明，采用本发明的方法后，扁桃酸的收率可以达到96% ;对所得的扁桃酸采用多种检测方法(如碱式滴定法、高效液相色谱和核磁共振等)进行检测，结果显示，表面分离纯化后的扁桃酸纯度高于99%。
【具体实施方式】
[0037]本发明提供了一种对由生物法合成的(R) - (_)-扁桃酸进行分离纯化的方法，其包括如下步骤:
[0038](I)、将扁桃腈流加入含有用于分泌J2315腈水解酶的E.coli工程菌的转化液中，在pH为6.0 - 9.0和温度为20 - 400C的条件下反应20 - 24h，停止流加并继续反应2 - 6h，得到反应液；
[0039](2)、对步骤(I)所得反应液进行前处理以去除不溶物，得到处理液；
[0040](3)、对步骤(2)所得处理液进行酸化处理，在20 - 30°C的温度下收集析出的晶体并得到酸化液；
[0041](4)、对步骤(3)所得酸化液进行浓缩处理，在20 - 30°C的温度下收集析出的晶体；
[0042](5)、合并步骤(3)和步骤(4)所得晶体，进行精制处理后得到(R)-(-)-扁桃酸。
[0043]其中，在步骤(I)中，J2315腈水解酶(BCJ2315)是伯克霍尔德氏菌J2315菌株(Burkholderiacenoce