用于病毒生产的细胞系和使用方法
【专利说明】用于病毒生产的细胞系和使用方法
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2013年2月5日提交的美国临时申请序列号61/760, 895和2013年 10月1日提交的序列号61/885, 357的权益，每份申请通过引用结合在此。
[0003] 政府资助
[0004]本发明是在联邦预算线5614A11101 "新发性传染病"下由政府支持进行的。政府 具有本发明中一定的权利。 发明领域
[0005] 本发明涉及用于增强病毒生产的组合物和方法。具体而言，这些组合物可以包括 基因（基因靶标）、所述基因靶标的效应物、以及其中基因靶标已被改变来增强病毒生产的 细胞系和细胞裂解物。
[0006] 背景
[0007] 疫苗是用来预防人类疾病的主要策略之一。当前，2种以上疫苗可用于对抗由病 毒传染引起的疾病（例如，水痘、乙型肝炎、麻疹、脊髓灰质炎）和细菌传染引起的疾病（例 如，霍乱、破伤风、伤寒、白喉）。类似地，疫苗用来预防家畜的许多疾患，这些家畜包括但不 限于：家禽、马、猪、以及其他动物。
[0008] 虽然若干疫苗（包括流感疫苗）仍然是产生于受精鸡卵（家鸡（Gallusgallus domesticus))中，但更多数量的疫苗是产生于细胞培养物中。在一种情况下，充分表征的细 胞系（例如，维洛细胞（VeroCell))首先感染活病毒或活的减毒病毒。随后，含有子代病 毒颗粒的上清液被收集和加工来产生之后可以分配到种群中的高度免疫原性剂量的疫苗。
[0009] 尽管疫苗被证明是成功的，但根除或控制疾病爆发的能力因疫苗生产的成本和制 造局限而重复受到挑战。脊髓灰质炎疫苗对此作出了最佳说明。脊髓灰质炎病毒是一种人 肠道病毒并且是脊髓灰质炎的病原体，这种神经变性剂的粪-口传播会导致急性麻痹。此 时，疫苗被产生来限制脊髓灰质炎的传播，并且包括高效（且明显更为昂贵）的灭活脊髓灰 质炎疫苗（IPV)以及效力略低（且更为经济）的口服脊髓灰质炎疫苗（OPV)。出于有关减 毒的OPV病毒颗粒会回复到高度传染性的神经毒性脊髓灰质炎病毒的技术原因，成功根除 脊髓灰质炎将借助于开发显著降低IPV制造成本的新技术。
[0010] 发明既述
[0011] 在此提供了可以由脊髓灰质炎疫苗制造厂家使用来显著降低OPV和IPV疫苗的生 产成本的一批基因、试剂以及细胞系。本发明提供调节（下调或过表达）时增强脊髓灰质炎 病毒复制的一列宿主基因（蛋白编码基因和非编码RNA)。因此，鉴别的基因可以被调节来 提高脊髓灰质炎病毒疫苗生产。另外，诸位发明人描述了可以被产生来增强脊髓灰质炎病 毒生产的一系列细胞系。以上全部可以单独或组合使用来增强用来对抗脊髓灰质炎以及其 他微小核糖核酸病毒感染的疫苗的生产。最后，诸位发明人描述了可以通过多种手段（例 如，siRNA、miRNA、小分子）调节来限制脊髓灰质炎病毒生产的一系列基因。
[0012] 在此提供了工程化的细胞系。在一个实施例中，该工程化细胞系的细胞具有选 自表I的与一种对照细胞系相比一个编码区的降低的表达，其中该编码区选自ZNF205、CNTD2、SEC61G、ETS1、TAF1L、MCCD1、LY6G6C、BTN2A1、GLXP3、GCGR、EP300。在一个实施例 中，该工程化细胞系的细胞具有选自表I的与一种对照细胞系相比一个编码区的降低的表 达。与该对照细胞系相比，该降低可以是至少5%。表达的降低可以通过测量细胞中由该编 码区编码的多肽或mRNA的量来确定。在一个实施例中，这些细胞在该编码区中或可操作地 连接到该编码区上的一个调节区中包括一个突变。在一个实施例中，这些细胞包括降低该 编码区的表达的一种外源多核苷酸。该外源多核苷酸可以是RNA多核苷酸如siRNA、shRNA、 或反义多核苷酸。在一个实施例中，这些细胞包括导致降低的表达的一个编辑基因组。例 如，该基因组可以由锌指核酸酶、大范围核酸酶或转录激活因子样效应物编辑。
[0013] 在一个实施例中，这些细胞进一步包括选自表I的至少一个另外的编码区的降 低的表达，与一种对照细胞系相比选自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、 miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9 的一 个miRNA的提高的表达，选自表IV的一个miRNA的降低的表达，或它们的组合。在一个实 施例中，这些细胞包括选自表I的至少五个编码区的降低的表达。在一个实施例中，这些 细胞进一步包括至少2个编码区的一个组合的降低的表达，其中编码区的这些组合选自表 VI。在一个实施例中，这些细胞包括选自表II的与一种对照细胞系相比一个编码区的提高 的表达。在一个实施例中，这些细胞进一步包括选自表II的至少一个另外的编码区的提 高的表达，与一种对照细胞系相比选自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、 miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9 的一个 miRNA的降低的表达，选自表IV的一个miRNA的降低的表达，或它们的组合。在一个实施例 中，这些细胞包括选自表II的至少五个编码区的提高的表达。
[0014] 在一个实施例中，该工程化细胞系的细胞包括与一种对照细胞系相比选自 miR_520e、miR-1256、miR-520d_3p、miR-513a_5p、miR-519c_3p、miR-1270-2、miR-3187、 miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9的一个miRNA的提高的表达。这些细胞可以 包括充当这些miRNA之一的一种miRNA模拟物。在一个实施例中，这些细胞进一步包括至 少两个miRNA的提尚的表达。
[0015] 在一个实施例中，该工程化细胞系的细胞包括选自表IV的与一种对照细胞系相 比一个内源miRNA的降低的表达。在一个实施例中，这些细胞在编码该miRNA的该编码区 中或可操作地连接到该编码区上的一个调节区中包括一个突变。在一个实施例中，这些细 胞包括抑制该内源miRNA的活性的一种miRNA抑制剂。
[0016] -个工程化细胞系的细胞可以包括一种微小核糖核酸病毒。在一个实施例中，该 微小核糖核酸病毒是一种脊髓灰质炎病毒如减毒的脊髓灰质炎病毒，例如，沙宾（Sabin) 1、 沙宾2、沙宾3。在一个实施例中，该脊髓灰质炎病毒选自Mahoney、Brunhilde、MEF-1、 Saukett、或它们的组合。在一个实施例中，该细胞系的细胞包括两种或三种脊髓灰质炎病 毒。在一个实施例中，该脊髓灰质炎病毒是肠道病毒71。
[0017] 该工程化细胞系可以是哺乳动物细胞系、禽类细胞系、或昆虫细胞系。在一个实施 例中，该哺乳动物细胞系选自人细胞系、非人灵长动物细胞系、犬细胞系、或仓鼠细胞系。在 一个实施例中，该哺乳动物细胞系是ffip-2或VeroP。在一个实施例中，该禽类细胞系是鸡 细胞系，或鸭细胞系。
[0018] 在此进一步提供了一种工程化细胞系的一种裂解物。
[0019] 在此提供了用于产生一种病毒的方法。在一个实施例中，该方法包括提供在此描 述的该工程化细胞系，其中该细胞系的细胞包括一种病毒；在适于通过这些细胞产生该病 毒的条件下孵育该工程化细胞系；任选地收获由这些细胞产生的该病毒。在一个实施例 中，该方法包括提供一个细胞系，其中该细胞系的细胞包括一种病毒；在适于通过这些细胞 产生该病毒的条件下孵育该细胞系，其中培养基包括抑制选自表I的一个编码区的表达的 一种RNA多核苷酸；并且任选地收获由这些细胞产生的该病毒。在一个实施例中，该RNA 多核苷酸可以是一种siRNA，一种shRNA，或一种反义多核苷酸，选自miR-520e、miR-1256、 miR-520d_3p、miR-513a_5p、miR-519c_3p、miR-1270-2、miR-3187、miR_5763p、miR-22、 miR-520c-3p以及miR-9的一种miRNA，抑制选自表IV的一种miRNA的活性的一种mRNA抑 制剂，或它们的组合。
[0020] 在一个实施例中，该方法包括提供一个细胞系，其中该细胞系的细胞包括一种病 毒，并且其中这些细胞包括会导致选自表I的一个编码区的降低的表达的一个编辑基因 组；在适于通过这些细胞产生该病毒的条件下孵育该细胞系；并且任选地收获由这些细胞 产生的该病毒。在一个实施例中，该基因组是由锌指核酸酶、大范围核酸酶或转录激活因子 样效应物编辑。在一个实施例中，该方法包括提供一个细胞系，其中该细胞系的细胞包括一 种病毒；在适于通过这些细胞产生该病毒的条件下孵育该细胞系，其中培养基包括抑制选 自表I的一个编码区的表达的一种小分子；并且任选地收获由这些细胞产生的该病毒。
[0021] -种方法中所使用的细胞可以包括一种脊髓灰质炎病毒。在一个实施例中，该微 小核糖核酸病毒是一种脊髓灰质炎病毒如减毒的脊髓灰质炎病毒，例如，沙宾1、沙宾2、沙 宾3。在一个实施例中，该脊髓灰质炎病毒选自]\&111〇1167、131'111111；[1(16、]\0^-1、33111^1:1:、或它 们的组合。在一个实施例中，所使用的这些细胞包括两种或三种脊髓灰质炎病毒。在一个 实施例中，该脊髓灰质炎病毒是肠道病毒71。
[0022] -种方法中所使用的细胞可以是哺乳动物细胞系、禽类细胞系、或昆虫细胞系。在 一个实施例中，该哺乳动物细胞系选自人细胞系、非人灵长动物细胞系、犬细胞系、或仓鼠 细胞系。在一个实施例中，该哺乳动物细胞系是ffip-2或VeroP。在一个实施例中，该禽类 细胞系是鸡细胞系，或鸭细胞系。
[0023] 还提供了用于治疗患有病毒感染、或处于患病毒感染的风险中的受试者的方法。 在一个实施例中，该方法包括在受试者的细胞中提高选自表I的一个编码区的表达。在 一个实施例中，该方法包括在受试者的细胞中抑制选自表II的一个编码区的表达。在一 个实施例中，该方法包括在受试者的细胞中抑制选自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、 miR-513a_5p、miR-519c_3p、miR-1270-2、miR-3187、miR_5763p、miR-22、miR-520c_3p以及 miR-9的一个内源miRNA的表达。在一个实施例中，该方法包括在受试者的细胞中提高选自 表IV的一种miRNA的表达。
[0024] 术语"和/或"意指所列举的要素的一个或所有或所列举的要素的任何两个或更 多个的组合。
[0025] 词语"优选的"和"优选地"指代本发明的在某些情况下可以提供某些益处的实施 例。然而，在相同或其他环境下，其他实施例也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施 例的叙述不意味着其他实施例是无用的，并且不意图将其他实施例排除在本发明的范围之 外。
[0026] 术语"包含"及其变体，在这些术语在本说明书和权利要求中出现的情况下，不具 有限制性含义。
[0027] 除非另外说明，"一个"、"一种"、"该"和"至少一个"可互换地使用并且意指一个或 多于一个。
[0028] 而且在此，通过端点叙述的数值范围包括该范围内所包括的所有数值（例如，1至 5 包括 1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等）。
[0029] 对于在此所披露的包括不连续的步骤的任何方法来说，可以按任何可行的顺序来 进行这些步骤。另外，在适当时，可以同时进行两个或更多个步骤的任何组合。
[0030] 图和表的简要说明
[0031] 图1.初步基因组范围内siRNA筛选的结果图示示出了使用一种脊髓灰质炎病毒 特异性ELISA筛选> 18, 200个基因的结果。这些筛选中所使用的病毒是沙宾2。Y轴线提 供标准化Z-评分。X轴线表示筛选的基因。
[0032] 图2.CCHD5ffJi定结果。图示示出了维洛细胞中的一批示例性单个基因的敲低如何 影响病毒滴度。Y轴线，标准化为非靶向对照（NTC)的病毒滴度。这些筛选中所使用的病毒 是沙宾2。X轴线提供基因名称。
[0033] 图3.空斑测定结果。（A)图提供了初步筛选中鉴别的靶基因的敲低如何提高总空 斑数（病毒滴度，即，病毒数）的实例。对照=非靶向对照siRNA。上清液的稀释液的范围 是从KT-4至KT-6。（B)图示示出了初步ELISA筛选中鉴别的一批命中区域的结果。NTC =非靶向对照。SiPoli0=靶向脊髓灰质炎病毒基因组的siRNA。这些筛选中所使用的病 毒是沙宾2。
[0034] 图4.抗原等效性研究结果。对在维洛细胞中产生的用靶向特异性基因的siRNA 未修饰或修饰的病毒进行抗原等效性研究。数值指示了中和来源于给定基因敲低的病毒的 感染性的一种标准化人血清池的稀释度。
[0035] 图5. 1型和3型脊髓灰质炎病毒（沙宾株）结果。用靶向初步（沙宾2)筛选中 鉴别的基因的siRNA转染的维洛细胞随后感染（A)I型脊髓灰质炎病毒（沙宾株）或（B) 3 型脊髓灰质炎病毒（沙宾）。使用实例1中描述的脊髓灰质炎病毒ELISA评定随后的上清 液。用靶向初步筛选中鉴别的基因的siRNA转染的维洛细胞随后感染（C)I型脊髓灰质炎 病毒（沙宾株）或（D) 3型脊髓灰质炎病毒（沙宾）。使用实例1中描述的空斑测定评定随 后的上清液。
[0036] 图6.miRNA模拟物筛选概述。在初步ELISA筛选中测试大于1，200个miRNA模拟 物以鉴别增强和降低脊髓灰质炎病毒抗原的基因。
[0037] 图7. CCHD5ffI定中各个miRNA模拟物的性能。初步筛选中鉴别的11种miRNA诱 导病毒滴度两倍或更多倍的增加。
[0038] 图8.A.示例性基因敲低（KD)数据。q-RT-PCR用来评定各个siRNA转染到维洛细 胞中之后的靶基因敲低的水平。9个基因沉默实验（ZNF205、SEC61G、ETSI、EP300、BTN21A、 611?史3、了4?1、]\10：01以及6061?)的结果显示典型地观察到70%的1(0或更大。8.图示示出 了单一基因敲低事件对七种不同的脊髓灰质炎病毒的影响。使29种单独的基因分别在维 洛细胞中沉默。随后，细胞感染七种不同的脊髓灰质炎株中的一种，包括沙宾1、沙宾2、沙 宾3、Mahoney(野生型I)、Brunhilde(野生型I)、MEF(野生型2)、以及Saukett(野生型3)。记录滴度是相对于在将一种非靶向对照SiRNA(NTC)转染到细胞中时所观察到的那些 而言的。另外的对照包括1)祀向脊髓灰质炎病毒（siPolio)的siRNA池、模拟感染（mock infections) (Mock)、以及在siRNA不存在（-siRNA)下用脂质转染试剂处理的细胞。实线 指示病毒滴度的4倍增加。点线指示病毒滴度的8倍（或更佳）增加。此数据为初步筛选 中鉴别的基因靶标的敲低会带来脊髓灰质炎病毒生产的增强提供进一步的支持。
[0039] 图9A和图9B.双基因敲低对多种脊髓灰质炎病毒株的滴度的影响的示例性数据。 深灰色条表示两种基因同时沉默时所观察到的病毒滴度的实际增加。浅灰色条表示基于各 个基因沉默时观察到的变化总和预测的滴度。表示观察到的滴度的增加大于单一事件 总和的事件（incidents)(P<0? 〇5)。
[0040] 图10. (A)基因沉默对EV71病毒生产的影响。用靶向脊髓灰质炎病毒RNAi筛选 过程中鉴别的若干基因中的一种的siRNA转染维洛细胞。在一个适当的基因沉默时间段之 后，将EV71添加到培养物中。随后，通过检测细胞病变效应（CPE)来评定相对滴度。（B)空 斑测定结果证实三种不同的基因（ZNF205、CNTD2和M(XDl)沉默如何影响EV71滴度。"RD 细胞"=横纹肌肉瘤细胞。（C)条形图量化了空斑测定的结果。实验重复进行三次，并且结 合一种非靶向对照siRNA(NTC)以及靶向EV71基因组的一种siRNA(siEV71)。
[0041] 表I.提供增加脊髓灰质炎病毒抗原和复制的124个基因的列表。表提供基因名 称、KEGG转换编号、以及来自初步脊髓灰质炎特异性ELISA的Z-评分值。
[0042] 表II.提供沉默时大大减少脊髓灰质炎病毒抗原和病毒生产的大于100个基因的 列表。
[0043]表III.提供具有诱导脊髓灰质炎病毒抗原和病毒生产增加的两个或更多个siRNA的68个基因（表I中鉴别的124个命中区域除外）的列表。表提供基因名称以及诱 导表型的siRNA的数目。
[0044] 表IV.提供大大减少脊髓灰质炎病毒抗原和病毒生产的宿主编码的miRNA的列 表。
[0045] 表V.基因、检索号、以及用来产生图8中的数据的siRNA序列的列表。
[0046] 表VI.以加合或协同方式增强脊髓灰质炎病毒生产的49个基因组合。
[0047] 展示性实施方式的详细说明
[0048]现将结合优选实施例来描述本披露。这些实施例被呈现来帮助理解本披露，并且 并不意图且不应被解释为以任何方式限制本披露。在阅读本披露之后对普通技术人员而言 可能变得显而易见的所有替代方案、修改以及等效物被包括在本披露的精神和范围内。
[0049] 关于基因命名，单一基因经常由多个符号表示。例如，在文献中，编码肽酰脯氨酰 异构酶B的亲环蛋白B基因