口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及口蹄疫病毒的分子生物学检测技术，具体地说，涉及口蹄疫病毒0型、 A型和AsiaI型三重实时荧光定量RT-PCR(FQ-PCR)检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV)引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染 病，对偶蹄兽有重大危害。口蹄疫病毒共有03、(：、341'1、3412、3413(即南非1、2、3型）和 AsiaI(亚洲I型）7个血清型，我国主要是0、A和AsiaI型，各个血清型的病毒之间不 能产生交叉免疫。因此，口蹄疫病毒快速准确的分型是口蹄疫诊断的重要内容，可为疫苗的 选择和流行病学研究提供有价值的信息。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供用于口蹄疫病毒0型、A型和AsiaI型三重实时荧光定量 RT-PCR(FQ-PCR)检测的引物和探针。
[0004] 本发明的另一目的是提供口蹄疫病毒0型、A型和AsiaI型三重FQ-PCR检测试 剂盒。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明提供的用于口蹄疫病毒0型、A型和AsiaI型三重 FQ-PCR检测的引物和探针，包括：
[0006] 0型FMDV检测引物和探针：
[0007] P1:5'-GSGCRCTCCTBCGNACK-3'
[0008] P2 :5'-YRTGYTTSACWGCYASYTCYARR-3'
[0009] Probe-P7 :5'-FAM-CYACYTACTAYTTCKCW-MGB-3' ；
[0010] A型FMDV检测引物和探针：
[0011] P3 :5,-CYGAGGCAGCACTGVAM-3，
[0012] P4 :5'-CGGYGCYTTGTGGTAAGC-3'
[0013] Probe-P8 :5'-VIC-CMCGAGCAACCCCA-MGB-3' ；
[0014] AsiaI型FMDV检测引物和探针：
[0015] P5 :5'-AAGAGCACCCAAACCCTTGA-3'
[0016] P6 :5'-GCCCCGACCAGTGTGTGT-3'
[0017]Probe-P9 :5'-NED-CTCATGCAGATCCCCT-MGB-3' ；以及
[0018] 共用反转录引物P0 :5' -CGGGAAACGCATGAGCAGTA-3' ；
[0019] 其中，S为G，C;R为A，G;B为C，G，T;N为A，C，G，T;K为G，T;Y为C，T;W为A， T;V为A，C，G;M为A，C。
[0020] 本发明还提供含有所述引物和探针的用于检测0、A和AsiaI型口蹄疫病毒的三 重实时荧光定量RT-PCR试剂盒。
[0021] 优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、逆转录酶、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲 液等中的一种或多种。
[0022] 更优选地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。其中，所述阳性对照为经灭活 的口蹄疫病毒〇型、A型和AsiaI型标准株细胞培养物；所述阴性对照为正常细胞培养液。 分别设置〇型、A型和AsiaI型检测体系为FAM、VIC和NED荧光通道。
[0023] 用于所述试剂盒的反转录体系为：5 XM-MLV缓冲液4 y L，2. 5mmol/L dNTP 4 y L， 20ymol/L共用反转录引物P01yL，M-MLV反转录酶0.5yL，RNase抑制剂0.5yL，样品 RNA10yL;反转录条件为：37°C，lh。
[0024] 用于荧光定量RT-PCR扩增反应的反应体系以25y1计为：引物P1、P2、P3、P4、P5、 P6 终浓度各为 0? 4ymol/L，Probe_P7 终浓度为 0? 4ymol/L，Probe_P8 终浓度为 0? 6ymol/ L，Probe-P9 终浓度为 0? 6ymol/L，2. 5mmol/LdNTPs2yL，10XExTaq酶缓冲液 2. 5yL， 5U/yLExTaqDNA聚合酶0. 25yL，cDNA模板4yL，去离子水补足至总体积25yL。
[0025] 扩增反应条件为：94°C5分钟；94°C15秒，60°C30秒，共40个循环。
[0026] 本发明进一步提供所述试剂盒在检测口蹄疫病毒和鉴别0、A和AsiaI型病毒中 的应用。具体地，所述应用包括以下步骤：
[0027] 1)提取待测病毒样品的总RNA，进行反转录获得cDNA;其中，反转录体系为： 5XM-MLV缓冲液 4yL，2.5mmol/LdNTP4yL，共用反转录引物P0lyL(20ymol/L)， M-MLV反转录酶0? 5yL，RNase抑制剂0? 5yL，RNA10yL;反转录条件为：37。。，lh〇
[0028] 2)进行荧光定量RT-PCR扩增反应；其中，反应体系以25y1计为：引物Pl、P2、 P3、P4、P5、P6 终浓度各为 0? 4ymol/L，Probe-P7 终浓度为 0? 4ymol/L，Probe-P8 终浓度 为 0? 6ymol/L，Probe-P9 终浓度为 0? 6ymol/L，2. 5mmol/LdNTPs2yL，lOXExTaq酶缓 冲液2. 5yL，5U/yLExTaqDNA聚合酶0. 25yL，cDNA模板4yL，去离子水补足至总体积 25yL；
[0029] 扩增反应条件为：94°C5分钟；94°C15秒，60°C30秒，共40个循环。
[0030] 在本发明中，检测结果的判定方式可以为：阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性 对照品扩增曲线的最高点为准，可根据不同仪器噪音情况进行调整。阴性对照的检测结果 应无特定的扩增曲线，且Ct值> 30. 0或无Ct;阳性对照的Ct值应< 25. 0,且出现特定的 扩增曲线，判定检测结果成立。如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为 无效。
[0031] 在检测结果成立的前提下：
[0032] 1)如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道出现1条特定的扩增曲线，且Ct值 < 32. 0,则可判定为样品中存在FMDV。
[0033] 2)如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道无特定的扩增曲线，且Ct值> 35. 0或无 Ct，则判定为FMDV阴性。
[0034] 3)如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道出现1条特定的扩增曲线，且32. 0 <Ct 值< 35. 0,则需重复检验，重复结果为阳性则判定为阳性，否则判定为阴性。
[0035] 4)若在"FAM/N0NE"标记模式下出现1条特定的扩增曲线且Ct值< 32. 0,表明样 品中存在FMDV-0型；若在"VIC/N0NE"标记模式下出现1条特定的扩增曲线且Ct值彡32. 0， 表明样品中存在FMDV-A型；若在"NED/N0NE"标记模式下出现1条特定的扩增曲线且Ct值 彡32. 0,表明样品中存在FMDV-AsiaI型。
[0036] 本发明提供的口蹄疫病毒0型、A型和AsiaI型三重实时荧光定量RT-PCR检测 引物和探针，以及基于所述引物和探针建立的三重实时荧光定量RT-PCR检测方法可实现 在一个反应中同时对〇、A、AsiaI3个血清型口蹄疫病毒进行快速鉴别检测，可在1-2h 内完成检测，具有快速、特异、敏感、高通量等优点，能满足大批量、快速鉴别检测0、A、Asia I3个血清型口蹄疫病毒的要求。
[0037] 本发明是以口蹄疫病毒2B基因设计口蹄疫病毒0型、A型和AsiaI型三个血清 型的共用反转录引物；再以口蹄疫病毒VP1基因作为扩增靶区域，设计3对口蹄疫病毒型特 异性引物和TaqManMGB探针，采用实时荧光定量RT-PCR技术，实现对口蹄疫病毒0型、A型 和AsiaI型三个血清型的检测。本发明提供的检测试剂盒适用于疑似口蹄疫病毒（FMD) 感染家畜的水疱皮、扁桃体、淋巴结等组织样品及水疱液、食道-咽部分泌液（0-P液）的病 毒核酸检测，灵敏度可达1. 〇X101拷贝/yL，同易与其混合感染或感染症状相似的其他病 原体，例如猪水疱性口炎病毒（VSV)、猪伪狂犬病毒（PRV)、猪瘟病毒（CSFV)、猪蓝耳病病毒 (PRRSV)、猪链球菌2型（SS2)、羊痘病毒（GPV)、牛病毒性腹泻病毒（BVDV)之间无交叉反 应。
【附图说明】
[0038] 图1为口蹄疫病毒0型、A型和AsiaI型三重实时荧光定量RT-PCR方法建立扩 增曲线；其中，1为FMDV-0灭活细胞毒扩增曲线；2为FMDV-A型灭活细胞毒扩增曲线；3为 FMDV-AisaI型灭活细胞毒扩增曲线；4~10为猪水疱性口炎病毒（VSV)、猪伪狂犬病毒 (PRV)、猪瘟病毒（CSFV)、猪蓝耳病病毒（PRRSV)、猪链球菌2型（SS2)、羊痘病毒（GPV)、牛 病毒性腹泻病毒（BVDV)扩增曲线，11为阴性对照扩增曲线。
[0039] 图2为口蹄疫病毒0型、A型和AsiaI型三重FQ-PCR方法检测0型口蹄疫病毒 敏感性扩增曲线；1~6分别对应的质粒浓