烟草青枯病菌实时荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，同时还涉及一种烟 草青枯病菌实时荧光定量PCR检测方法，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 烟草青枯病是由青枯假单包杆菌引起的维管束病害，以土壤传播为主，是威胁烟 草生产的毁灭性病害之一，一旦发病即可造成全株死亡，对烟草的产量和质量造成极大影 响。在我国长江流域及其以南烟区普遍发生，其中以广东、福建、台湾、湖南、江西、广西东 部、安徽南部、四川及贵州局部烟区危害严重，个别年份暴发流行，常与根黑腐病、黑胫病、 根结线虫病混合发生。许多烟田发病率达50 %以上，在极端气候下发病率可高达80 %~ 90%，造成毁灭性损失，已成为我国烟草生产及其经济效益上的重要制约因素。
[0003] 烟草青枯病一旦发生，防治难度较大，因此需要在发生前快速、准确地检测潜伏在 植烟土壤中青枯病菌的数量，对控制青枯病菌具有重要意义。
[0004] 目前，对病害的检测方法主要有常规测定法、血清学方法和分子生物学方法等， 常规测定法主要是通过选择性培养基来分离病菌病根据形态进行鉴定的方法，其缺点是 检测周期长，初学者误判率高。血清学技术检测微生物病原菌准确度较高，但是该技术操 作过程较为复杂，灵敏度不高。而荧光定量PCR技术是近年来发展起来的一种高通量、高 灵敏度的检测技术，在病原微生物的检测方面应用很广，但目前应用实时荧光定量PCR技 术检测R.solanacearum的报道较少。2000年Weller等根据设计特异TaqMan探针，通 过实时荧光定量PCR特异检测R.solanacearum;2005年漆艳香等根据香蕉细菌性枯萎病 菌（R.solanacearumrace2) 16SrDNA序列的高变区，设计引物RsF/RsR和TaqMan探针 Rsprobe，用实时焚光PCR对R.solanacearumrace2进行检测，其检测灵敏度为24. 6fg/ yL悬液。
[0005] 锁核酸（Lockednucleicacid，LNA)是一种寡核酸衍生物，其结构中0-D-咲 喃核糖的2-0, 4-C位通过缩水作用形成环形的结构如氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基 桥，呋喃糖的结构锁定在C3内型的N构型，形成刚性的缩合结构。LNA的这个环形桥能锁定 呋喃糖的N构型，降低核糖结构的柔韧性，增加磷酸盐骨架局部结构的稳定性，具有较强的 杂交性和稳定性。在寡核苷酸中加入锁（LNA)修饰碱基可显著增强寡核苷酸与DNA的结合 能力。
[0006] R. solanacearum是一种严重危害烟草的病原细菌，Realtime-PCR检测技术的研 究将为烟草青枯病的预防提供重要依据。但目前的检测方法灵敏度仍然较低，尤其是针对 土壤中低拷贝的病菌，需要更加敏感的烟草青枯病检测试剂和检测方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，其能够快 速、高敏感度地检测植烟土壤中青枯病菌的数量。
[0008] 同时，本发明还提供一种烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测方法，其操作过程 简单，检测时间短，敏感度高，安全可靠。
[0009] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0010] 烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，其包含以下引物：
[0011] 正向引物：5'-TACCGCAICAAAQAGGGCAG-3'（如SEQIDNO. 1 所示），
[0012] 反向引物：5' -CTTCTGSGGTGIGCAATCCT-3'（如SEQIDNO. 2 所示）；
[0013] 其中，下划线表示LNA修饰位点。
[0014] 具体的，烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测试剂盒还可以包含2X荧光定量PCR 反应混合液、标准阳性对照样品、DNAMarker、超纯水等。所述标准阳性对照样品为包含青 枯病菌胞外葡聚糖酶基因（endoglucanase，缩写EG)片段的DNA。
[0015] 烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：以待测样品DNA为模 板，利用正、反向引物进行SYBRGreenI荧光定量PCR扩增；扩增片段为246bp时，将待测 样品DNA的CT值代入以青枯病菌拷贝数对数值为X轴、CT值为Y轴制作的标准曲线中，得 至IJPCR反应体系中青枯病菌的拷贝数；将拷贝数代入以下公式计算得到单位质量待测样品 中青枯病菌的定殖数量；
[0016] C = QX (VDNA/VPCR) X (l/ffEXT),
[0017] 式中：C为单位质量待测样品中青枯病菌的定殖数量；Q为PCR反应体系中青枯病 菌的数量；VDNA/Vrc#待测样品的稀释倍数，其中VDNA为待测样品稀释后的总体积，VPeR为加 入PCR反应体系中的稀释后待测样品的体积；WEXT为待测样品的质量。
[0018] 所述待测样品可以为烟区感染青枯病烟株附近土壤。
[0019] 所述正、反向引物如下：
[0020] 正向引物：5' -TACCGCAICAAASAGGGCAG-3 '，
[0021] 反向引物：5' -CTTCTGSGGTGIGCAATCCT-3'（下划线表示LNA修饰位点）。
[0022] 所述SYBRGreenI荧光定量PCR扩增的反应体系为：2X荧光定量PCR反应混合 液12. 5yL，待测样品DNA溶液1yL，10ymol/L正/反向引物各1yL，ddH20补足至25yL。
[0023] 所述SYBRGreenI荧光定量PCR扩增的反应条件为：95°C热启动，8min预变性； 扩增循环：95°C30s，60°C10s，72°C20s，循环 45 次。
[0024] 所述标准曲线的利记博彩app为：
[0025] 1)以标准阳性对照样品为模板，利用正、反向引物（同上）进行SYBRGreenI荧光 定量PCR扩增，得到大小246bp的扩增片段，回收扩增片段并将其插入到载体pMD18-T中， 转化大肠杆菌并筛选阳性克隆，提取质粒，经酶切鉴定正确后得到重组质粒PMD18T-EG;
[0026]2)将重组质粒pMD18T-EG制成逐级稀释液（即若干浓度梯度液），再利用正、反 向引物进行SYBRGreenI荧光定量PCR扩增，记录每级稀释液的CT值（每级稀释液均扩 增出246bp产物），以每级稀释液中青枯病菌拷贝数对数值为X轴、CT值为Y轴制得标准曲 线。
[0027] 步骤1)中所述标准阳性对照样品为包含青枯病菌胞外葡聚糖酶基因片段的（质 粒）DNA。
[0028] 步骤1)、2)中所述SYBR Green I荧光定量PCR扩增的反应体系为：2X荧光定 量PCR反应混合液12. 5yL，标准阳性对照样品或重组质粒pMD18 T-EG逐级稀释液1yL， 10ymol/L正/反向引物各1yL，ddH20补足至25yL。
[0029] 步骤1)、2)中所述SYBRGreenI荧光定量PCR扩增的反应条件为：95°C热启动， 8min预变性；扩增循环：95°C30s，60°C10s，72°C20s，循环 45 次。
[0030] 步骤1)中所述筛选阳性克隆采用含氨苄青霉素的LB培养基，氨苄青霉素在LB培 养基中的浓度为100ng/mL，培养24h后采用质粒试剂盒提取质粒。
[0031] 步骤2)中所述逐级稀释液的制备方法为：将步骤1)中重组质粒pMD18T-EG经紫 外分光光度计A260定量，测量值即为质粒母液的质量浓度，用灭菌后的超纯水稀释成若干 浓度梯度，即得。
[0032] 本发明的有益效果：
[0033] 本发明以青枯病菌EG基因区域片段为目标检测序列，采用LNA技术合成覆盖目标 片段的引物序列，结合荧光定量核酸扩增技术，得到一种高灵敏度、高效快速检测烟草青枯 病菌的荧光定量核酸扩增检测试剂盒。
[0034]与普通引物常规荧光定量PCR检测烟草青枯病菌相比，本发明中锁核苷酸（LNA) 增敏的烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法适用于植烟土壤青枯病菌 的定量检测，具有以下优势：高通量，高灵敏度，检测时间较短，操作过程简单，对待测样品 要求较低等。无论是沙质土、壤土、红土还是染病的生长烟株或田间残留烟体等，均能取得 较准确的检测结果。
[0035] 本发明中锁核苷酸（LNA)增敏的烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测试剂盒及检 测方法，相较普通定量PCR技术更加高效、快速，操作简单且价格低廉，对环境中微量青枯 病菌的检测具有十分重要的意义，将对我国烟草青枯病的防控起到积极作用。
【附图说明】
[0036]图1为本发明实施例3中青枯病菌EG基因扩增片段的电泳图；
[0037] 图2为青枯病菌EG基因扩增片段测序结果；
[0038] 图3为质粒母液逐级稀释液的扩增曲线；
[0039]图4为以青枯病菌拷贝数对数值为X轴、CT值为Y轴建立的标准曲线；
[0040] 图5为待测土壤样品DNA溶液的扩增曲线；
[0041] 图6为待测土壤样品DNA溶液的溶解曲线。
【具体实施方式】
[0042] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0043] 实施例1
[0044] 本实施例中烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测试剂盒包含以下引物：
[0045]正向引物：5 '-TACCGCAICAAASAGGGCAG-3'，
[0046] 反向引物：5'-CTTCTGSGGTGIGCAATCCT-3'（下划线表示LNA修饰位点）。
[0047] 实施例2
[0048] 本实施例中烟草青枯病菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，包含：2X荧光定量 PCR反应混合液20mL，标准阳性对照样品（包含青枯病菌胞外葡聚糖酶基因片