一种vkorc1基因扩增的检测引物组及试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种SNP的试剂盒，具体讲，涉及一种VK0RC1基因扩增的检测引物组 及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 华法林是临床常用治疗血栓性疾病的一种香豆素类口服抗凝药，具有抗凝和溶 栓的双重作用。华法林的抗凝治疗指数范围狭窄，如果剂量不足则达不到治疗效果，剂量 稍过量则会引起出血，重者危及病人生命。然而，华法林血浆药物浓度和疗效存在明显的 个体差异和种族差异，有研究表明，不同患者使用抗凝血药物华法林的剂量可以相差20 倍，亚洲人的维持剂量比白种人要低30%~40%。因此，如何在临床上安全、合理使用华 法林长期以来是许多研究者关注的重点和难点。
[0003] 近年来，随着药物基因组学的发展和华法林药理作用分子机制的阐明，单核苷酸 基因多态性在华法林用量个体差异中的作用越来越受到人们的重视。目前，已知与华法林 的药效学和药动学相关的基因达30余种，维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1基因 (VtaminKepoxidereductasecomplexsubunit1，VK0RC1)的基因多态性是影响华法林 用量个体差异最主要的遗传因素之一。维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1 (VK0RC1) 使还原型维生素K表氧化，可使凝血因子II、VE、IX和X以及蛋白C和蛋白S活化而产生凝 血效应。华法林是维生素K的拮抗剂（VKA)，通过抑制肝脏环氧化还原酶而产生抗凝作用。 因此，VK0RC1决定了华法林的抗凝效果。
[0004] 维生素K环氧化物还原酶（VK0R)是华法林作用的靶蛋白。华法林通过抑制VK0R， 使无活性的氧化型（环氧化物型）VK无法还原为有活性的还原型（氢醌型）VK而起到抗 凝作用。多个VK0RC1的SNP位点被发现与华法林用量个体差异相关，该基因目前主要研 究的位点是_1639A>G(SNPrs9923231)，携带-1639G的患者，其对华法林的需求量较携 带-1639AA的患者高。研究表明，VK0RC1-1639G/A基因多态性存在民族差异，其基因多态 性是民族之间华法林剂量差异的主要原因。
[0005] 华法林有R和S两个亚型，其中S型抗维生素K的作用最明显，R型在体内基本不 起作用，S型华法林直接作用于维生素K环氧化物还原酶，使维生素K的氧化型和还原型不 能相互转化，从而抑制维生素K的功能，同时也抑制一些凝血因子的激活。大量研究证明， VK0RC1基因多态性可影响华法林的起始使用剂量，VK0RC1GG型用药剂量最高，GA型次之， AA型最低。华法林在不同种族、年龄、性别人群中的剂量千差万别，很大的原因在于VK0RC1 基因的多态性。而在VK0RC1基因中，通过检测位点的多态性然后再结合患者相关临床信息 运用药理遗传学的相关法则基本上可确定华法林的起始使用剂量。
[0006] 美国FDA批准的基因诊断和检测项目有2000项左右，其中1290多项已完全批准 用于临床，大约1000项正在审批过程中。实践证明，基因多态性检测是有效的。我国应该 使用华法林而未使用的人群达90%左右，房颤患者仅有6. 6%正确使用华法林，其原因是 不能确定华法林使用的准确剂量，不能规范监测INR。这样，房颤导致卒中患者明显增加，临 床统计显示大约有1/3的脑卒中患者由房颤引起。倘若临床医生通过基因检测的手段来确 定华法林的起始使用剂量，安全使用华法林，就会减少房颤的致残率和致死率。
[0007] 以下是现在对VK0RC1的分型方法。
[0008] Taqman方法：针对SNP位点变异设计特异性的探针，探针标记成本较高；采用荧光 淬灭及双末端标记技术，有淬灭难以彻底、本底较高的缺陷；采用酶外切活性，定量时受酶 性能的影响。
[0009] DHPLC技术和质谱分析：分别需要用到高效液相色谱仪与质谱仪，设备昂贵，难以 在临床诊测中推广。
[0010] DNA芯片：由于高通量等优点在SNP检测中得到大量应用，但其依靠野生型与突 变型基因杂交动力学的差异对突变位点进行检测，由于不同位点之间的杂交动力学差异不 同，在进行多位点同时检测时条件难以控制、可重复性差，易出现假阳性假阴性结果。
[0011] 微测序：作为一种基于阵列的突变分析，目前还面临着如何降低假阴性率和靶核 苷酸序列组成的变异等关键问题。
[0012] 高温连接酶法：高温连接酶检测反应（ligasedetectionreaction，LDR)是近几 年逐渐引起人们注意的一种新型基因多态性检测方法，该技术操作简单、稳定，结果可靠。 俗称小测序。
[0013] 限制性酶切方法（RFLP):准确性较好，费用也较低.但只能对一部分含有现成酶 切位点的多态位点进行分型。
[0014] SNaPshot法：基于焚光标记单碱基延伸原理的分型技术，通常用于10-30个SNP 位点分析。
[0015] DNA测序法：相对准确，价格较贵。DNA链的二级结构容易造成人工假相，使测序 结果出现偏差。
[0016] 高分辨率熔解曲线法（HRM):是近几年兴起的SNP研究工具该方法，无需设计探 针，成本低，但结果准确度较低。
[0017] 扩增阻碍突变系统（Amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)):本技 术通过涉及特异性的引物，有选择性的扩增野生或突变模版，通过扩增产物的量来确定是 否为野生型或突变型，利用PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增 的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3'碱基与模板配 对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变。在不同的引物上加上3个T对扩增出的片段 进行区分。
[0018] 毛细管电泳（capillaryelectrophoresis，CE)又称高效毛细管电泳（high performancecapillaryelectrophoresis，HPCE)，是一类以毛细管为分离通道、以高压直 流电场为驱动力的新型液相分离技术。毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，它 使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。
[0019] 目前国内对VK0RC1的研究尚属空白，更没有成熟的检测方法或试剂。
[0020] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0021] 本发明提供一种VK0RC1基因扩增的检测引物组；
[0022] 本发明提供一种VK0RC1基因扩增的检测试剂盒。
[0023] 为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：VK0RC1基因扩增的检 测引物组，所述VK0RC1检测引物组包括：
[0024] VK0RC1-PD-F1 :如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，或由SEQ ID N0:1所示的核苷 酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；
[0025] ￥1(01^1-?042:如3￡〇10勵:2所示的核苷酸序列，或由3￡〇10勵 :2所示的核苷 酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；
[0026] VK0RC1-PD-R :如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，或由SEQ ID N0:3所示的核苷 酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；
[0027] 所述VK0RC1-PD-R为荧光引物，其5'端标记有荧光基团；
[0028] 作为本发明的优选技术方案，所述荧光基团选自由6-羧基荧光素、六氯-6-甲基 荧光素、VC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗 丹明、6-羧基-4'，5' -二氯-2'，7' -二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5和花 菁5. 5中的至少一种。
[0029] 作为本发明的优选技术方案，所述VK0RC1-PD-R的荧光基团为6-羧基荧光素。
[0030] VK0RC1基因扩增检测试剂盒，包括以上所述的VK0RC1基因扩增的检测引物组。
[0031] 作为本发明的优选技术方案，还包括含Mg2+、Taq酶及dNTPs的PCR反应液。
[0032] 作为本发明的优选技术方案，还包括阴性质控品、阳性质控品；
[0033] 所述阴性质控品为纯化水；所述阳性质控品为灭活全血。
[0034] 作为本发明的优选技术方案，所述试剂盒分为阴性质控品、阳性质控品、VK0RC1反 应体系；
[0035] 所述VK0RC1反应体系包括VK0RC1PCR反应液12. 5yL，VK0RC1引物混合液 6. 5yL，待测样本DNA2yL，纯化水4yL，共配成25yL反应体系；
[0036] 其中所述VK0RC1引物混合液的组成为：1. 5yL的VK0RC1-PD-F1，1. 5yL的 VK0RC1-PD-F2,1. 5yL的VK0RC1-PD-R。
[0037]VK0RC1阳性质控品的构建方法包括以下步骤：
[0038] (1)用无菌注射器在受检者手臂弯曲处或手背处抽取静脉血3~5mL，置于EDTA 抗凝管（紫盖）内，轻轻颠倒混匀；
[0039] (2)用天根全血试剂盒进行基因组提取；
[0040] (3)提纯的基因利用紫外分析法测定吸光度，计算浓度，最佳浓度为50ng/ml。
[0041] VK0RC1基因扩增检测试剂盒的使用方法，具体过程如下：
[0042] (1)样本处理和核酸提取；
[0043] (2)进行PCR反应；
[0044] (3)通过基因分析仪检测，得到片段分析结果。
[0045] 所述的待测样本的处理方法包括：磁珠提取法、柱提法、煮沸裂解法和十六烷基三 甲基溴化铵法，优选柱提法。
[0046] 作为本发明的优选技术方案，步骤（1)中所述的样本为人类基因组DNA，0D260/ 0D280 在 1. 8-2. 0,DNA总量在 3-15yg,稀释DNA的终浓度至 50-125ng/yL。
[0047]作为本发明的优选技术方案，稀释DNA的终浓度至50ng/ y L。
[0048] 作为本发明的优选技术方案，步骤（2)中PCR反应的反应条件为：37°C保温2分钟 后；95°C预变性3分钟，92~95°C，10~15秒，55