一种鉴别玉米单倍体幼胚的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别玉米单倍体幼胚的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 玉米是一种利用杂种优势的模式作物，玉米育种过程中最为关键的环节是纯系选 育。常规玉米自交系的选育需要经过多代的自交选择，因此选育一个品种往往需要数年的 时间；而且理论上讲，即使自交n(n〇c)代，基因型也不能达到100%的完全纯合状态。利 用孤雌生殖诱导系诱导产生单倍体并进行人工加倍，只需两代就可以得到100%纯合的自 交系，与常规方法相比不仅大大缩短育种进程，而且节约大量的人力、物力和财力。
[0003] 单倍体育种的首要步骤是单倍体的鉴别，因此单倍体鉴别技术在玉米单倍体育种 中具有很重要的地位。目前，国内外对玉米单倍体的鉴别进行了大量的研究，主要从单倍 体植株形态学水平以及成熟籽粒性状对单倍体进行鉴别，另外也有通过观察籽粒染色体数 目、DNA含量、分子标记等细胞生物学及分子生物学水平进行单倍体鉴别。对玉米单倍体的 形态学进行鉴别研究，主要基于Rl-nj基因的遗传标记法，基于Rl-nj基因的遗传标记法是 目前应用最为广泛的鉴定方法。该方法主要利用了AlA2ClC2BPlRl-nj显性遗传标记系统。 在Al、A2或C2基因的存在下，Rl-nj基因导致胚乳糊粉层和胚中盾片附着紫色。Nanda和 Chase(1966)首次利用了该颜色标记系统去鉴别单倍体，用含有Rl-nj基因的玉米单倍体 诱导系授粉，在诱导系授粉杂交的果穗中，杂合二倍体由于Rl-nj基因在胚和胚乳中同时 表达而表现为胚和胚乳糊粉层均为紫色，单倍体由于孤雌生殖表现为胚乳糊粉层为紫色， 胚为无色。通过观察玉米成熟籽粒胚和胚乳颜色情况，即可将单倍体挑选出来。根据单倍 体植株形态学鉴别单倍体目前广泛采用的方法是利用B1和P11基因可以在植株茎杆表达 的特点，将AlA2ClC2Rl-nj标记系统下挑选的拟单倍体种植于田间，在幼苗期植株表现为 紫色的确定为杂株，植株表现为绿色的确定为单倍体，但是B1和P11这些基因也会受到环 境因素诸如光照和温度的影响而影响鉴定的准确性（Chaikam和Prasanna, 2012)。目前选 育的单倍体诱导系均含有AlA2ClC2Rl-nj遗传标记，有些诱导系还含有B1和P11基因。
[0004] 通过Rl-nj基因在成熟籽粒的表达情况或者田间植株形态等单倍体鉴别方式周 期长，工作量大，浪费大量人力、物力、财力。从分子水平鉴别单倍体，过程繁杂，价格昂贵， 不适合高通量鉴别，因而不能广泛应用到生产实践当中去。因此探索一种高效的玉米单倍 体鉴别方法对玉米育种同样具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是单倍体育种过程中单倍体鉴别工作量大、准确率低和 鉴别时期晚的问题。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种玉米单倍体幼胚的鉴别方法。
[0007] 本发明提供的玉米单倍体幼胚的鉴别方法包括如下步骤：用玉米单倍体诱导系作 为父本给母本授粉，授粉后取幼穗进行剥胚，得到玉米幼胚；将所述玉米幼胚在培养基中培 养，从所述玉米幼胚中选取没有显色的玉米幼胚，得到玉米单倍体幼胚；
[0008] 所述玉米单倍体诱导系含有AlA2ClC2Rl-nj标记。
[0009] 上述方法中，所述培养的条件为光照培养48h;所述光照的强度为250001X;所述 光照的周期为24h/天。
[0010] 上述方法中，所述剥胚为取长为2. 0-4. 0mm的玉米幼胚的幼穗进行剥胚。
[0011] 上述方法中，所述培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质在所述培养基中的浓度： MS盐 3. 0-4. 5g/L、蔗糖 30-60g/L、琼脂 7. 5g/L。
[0012] 上述方法中，所述培养基的pH为7-9。
[0013] 上述方法中，所述溶质在所述培养基中的浓度：MS盐3.0g/L、蔗糖40g/L、琼脂 7. 5g/L〇
[0014] 上述方法中，所述培养基的pH为7。
[0015] 上述方法中，所述培养的温度为26_30°C;所述培养的湿度为60%。
[0016] 上述方法中，从所述玉米幼胚中选取没有显色的玉米幼胚为选取玉米幼胚盾片部 位无色的幼胚，得到玉米单倍体幼胚。
[0017] 上述方法中，所述玉米单倍体诱导系为农大高诱1号、农大高诱2号、农大高诱3 号、农大高诱4号、农大高诱5号或农大高油高诱3号。
[0018] 上述方法中，所述母本为郑单958、先玉335、郑58或Mo17。
[0019] 上述方法在培育玉米单倍体植株中的应用也属于本发明的保护范围。
[0020] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育玉米单倍体植株的方法。
[0021] 本发明提供的培育玉米单倍体植株的方法包括如下步骤，将上述方法得到的单倍 体幼胚再生培养，得到植株，根据株型和/或茎杆颜色选取玉米单倍体植株。
[0022] 上述方法中，所述根据株型和/或茎杆颜色选取玉米单倍体植株的方法为：当玉 米单倍体诱导系植株颜色为紫色时，根据植株茎杆颜色选取玉米单倍体植株：紫色为杂合 二倍体植株，而无色为单倍体植株；当玉米单倍体诱导系植株颜色为无色时，根据植株株型 选取玉米单倍体植株：植株高大或叶片披散为杂合二倍体植株，而植株矮小或叶片上冲为 单倍体植株。
[0023] 上述方法中，所述诱导系植株颜色为紫色的诱导系为CAUH0I、CAU2、CAU3或CAU4;
[0024] 所述诱导系植株颜色为无色的诱导系为CAU5或CH0I3。
[0025] 上述方法中，所述再生培养的培养基的制备方法：每升再生培养基中含有MS盐 1. 5g，蔗糖30g，待溶解后定容至1L，调节pH值至7,倒入三角瓶中，加7. 5g琼脂。
[0026] 通过实验证明：本发明的鉴别单倍体幼胚的方法可在玉米幼胚时期实现单倍体的 鉴别，并且准确率高，挑选速度快，比常规籽粒成熟时期单倍体挑选提前30-35天，解决了 单倍体鉴别耗时长的问题，丰富了单倍体鉴别的方法，缩短育种时间，使单倍体育种技术的 大规模应用途径更加多样化，加速单倍体育种工程化进程。
【附图说明】
[0027] 图1为连续培养48h幼胚显色情况。
[0028] 图2为培养时间过长，幼胚生根发芽。
【具体实施方式】
[0029] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0030] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0031] 玉米（ZeamaysL.)杂交种郑单958和先玉335为下述实施例中的母本，是北京 德农种业有限公司的产品。
[0032] 郑58和M〇17均为优良自交系，均在文献"董昕（2014);玉米单倍体诱导基因 qhirl精细定位与新型诱导系选育研究，博士论文"中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0033] 玉米单倍体诱导系农大高诱1号（CAUH0I)、玉米单倍体诱导系农大高诱2 号（CAU2)、玉米单倍体诱导系农大高诱3号（CAU3)、玉米单倍体诱导系农大高诱4号 (CAU4)和玉米单倍体诱导系农大高诱5号（CAU5)均为下述实施例中的父本，均含有 AlA2ClC2Rl_nj标记，均在文献"Dong,X.，etal. (2014). "Marker-assistedselection andevaluationofhighoilinvivohaploidinducersinmaize.''Molecular Breeding34(3) : 1147-1158. "中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0034] 玉米单倍体诱导系农大高油高诱3号（CH0I3)为下述实施例中的父本，含有 AlA2ClC2Rl-nj标记，在文献"董昕，2014,玉米单倍体诱导基因qhirl精细定位与新型诱导 系选育研究"中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0035] 基本MS培养基的制备方法：每升基本MS培养基中含有MS盐3. 0g，蔗糖30g，待溶 解后定容至1L，调节pH值至5. 8,倒入三角瓶中，加7. 5g琼脂。
[0036] MS培养基的制备方法：将基本MS培养基中的蔗糖变为40g，使蔗糖在所述MS培养 基中的浓度为40g/L，且调节pH值至7,且其他物质和浓度保持不变的基本MS培养基。
[0037] 再生培养基的制备方法：每升再生培养基中含有MS盐1. 5g，蔗糖30g，待溶解后定 容至1L，调节pH值至7,倒入三角瓶中，加7. 5g琼