一种用于快速鉴定具条实蝇的种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种用于快速鉴定具条实蝇的 种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 具条实绳，拉丁学名为：Bactrocerascutellata(Hendel)，属双翅目Diptera实 绳科Tephritidae果实绳属Bactrocera，是一种重要的入侵检疫性害虫。目前，具条实绳 在世界范围的分布比较局限，主要分布在越南（龚秀泽，2003)、印度（梁日崇等，1985)、緬 甸（邓裕亮等，2005)、老挝（邓裕亮等，2010)、日本（梁广勤等，1989;Miyatakeetal.， 2000)及韩国（Munetal.，2000)等地。我国是具条实蝇世界上具条实蝇的主要分布地区 之一，目前主要分布在台湾、广东、广西、福建、浙江、江西、海南、云南、贵州、四川、湖北和陕 西（梁日崇等，1985;梁广勤等，1989)。
[0003]具条实蝇危害的植物寄主非常广泛，主要危害茄科植物及瓜类，包括南瓜、丝瓜、 苦瓜、黄瓜、冬瓜、柑橘、柚、西瓜、木瓜、番茄、茄子、辣椒、番石榴、芒果等具有经济价值的果 蔬。具条实蝇在植物组织内部生长发育，成虫只取食液态食物，幼虫植食性，在果实内部取 食。由于其幼虫植食性，具条实蝇的经济重要性不仅能造成水果和蔬菜产量的直接锐减，增 加了防治的费用，还影响水果蔬菜的进出口贸易和增加建立控制和根除具条实蝇的费用， 因此我国也将具条实蝇列为检疫性害虫。近二十多年以来，具条实绳在我国的分布范围急 剧扩大，对我国经济造成很大影响，因此，非常有必要研究具条实蝇快速鉴定的新方法，实 现对具条实蝇的快速鉴定。
[0004] 由于对具条实蝇的成虫形态鉴别远比对幼虫、卵或蛹的鉴别容易，因此，为了保证 鉴定的准确性目前的检疫监管机构，通常采用的具条实蝇疫情的鉴别方法为形态学鉴别方 法，即：首先将截获的实蝇幼虫、卵或蛹在室内饲养为成虫，然后通过观察成虫形态，而鉴别 其是否为具条实蝇。该种鉴别方法存在的主要问题为：（1)将幼虫、卵或蛹饲养为成虫，需 要花费较长的时间，严重影响了果蔬进出口贸易的通关速度；（2)如果截获果蔬中实蝇的 头、胸、腹、翅、足等残体，由于无法将上述残体饲养为成虫，因此，无法准确识别所截获的残 体是否为具条实蝇的残体，具有较大的鉴别局限性。
[0005]可见，现有技术中，为了防止检疫性具条实蝇传入以及扩散，迫切需要一种可克服 形态学鉴别方法的不足、能够快速准确鉴定具条实蝇的鉴别方法。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种用于快速鉴定具条实蝇的种特异性引 物对、试剂盒及鉴定方法，能够快速准确的对截获的疑似具条实蝇的幼虫、卵、蛹，以及头、 胸、翅、腹、足等残体进行鉴别。
[0007] 本发明采用的技术方案如下：
[0008] 本发明提供一种用于快速鉴定具条实蝇的种特异性引物对，包括上游引物JF190 和下游引物JR386;
[0009] 所述上游引物JF190的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示；
[0010] 所述下游引物JR386的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0011] 本发明还提供一种用于快速鉴定具条实蝇的试剂盒，所述试剂盒包括以下引物：
[0012] 上游引物JF190,其核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示；
[0013] 下游引物JR386,其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0014] 优选的，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液中的至少一种；所述试剂盒还包括标 准阳性模板。
[0015] 本发明还提供一种采用权利要求1所述的种特异性引物对快速鉴定具条实蝇的 方法，包括以下步骤：
[0016]S1，设计具条实蝇的种特异性引物对；其中，所述具条实蝇的种特异性引物对包括 上游引物JF190和下游引物JR386;
[0017] 其中，上游引物JF190的核苷酸序列如SEQIDN0:1所示；下游引物JR386的核苷 酸序列如SEQIDN0:2所示；
[0018]S2,提取被鉴定生物体的DNA;
[0019] S3,以S2提取的DNA为模板，使用S1得到的所述具条实蝇的种特异性引物对进行 SS-PCR扩增反应；
[0020] S4,采用电泳检测SS-PCR扩增产物，判断所述SS-PCR扩增产物是否含有197bp的 特征条带，如果含有，则所述被鉴定生物体为具条实蝇种；反之，则所述被鉴定生物体不为 具条实蝇种。
[0021] 优选的，S1中，通过以下方法设计得到具条实蝇的种特异性引物对：
[0022] S1. 1，选用具条实蝇的标本，采用试剂盒法从所述具条实蝇的标本中提取具条实 蝇的基因组DNA。
[0023] 优选的，S2中，所述被鉴定生物体的DNA具体为：来自卵生物形态的DNA、来自幼虫 生物形态的DNA、来自蛹生物形态的DNA、来自生物残体的DNA;
[0024] 其中，所述生物残体指头、胸、腹、翅或足；
[0025] 此外，通过以下方法，提取被鉴定生物体的DNA:
[0026] 选用整只具条实蝇、或具条实蝇的残体、或具条实蝇的卵、幼虫或蛹作为样本；将 所选用的样本置于2ml离心管中，加入液氮充分研磨；然后，将研磨后的样本采用OMEGA E.Z.N.A.?InsectDNAKit试剂盒法提取DNA，并将最终提取到的DNA保存于-20°C备用。
[0027] 优选的，S3中，所述SS-PCR扩增的反应体系以25ul计，包括：
[0028] 25.21x1 〇_kg/u丨模板I)NA 2ul 2:0uM上游引物JF190 lul 20uM下游引物JR386 lul 2^EasyTaqPC'RSuperMix 12.5ul ddH20 补足至 25ul。
[0029] 优选的，所述SS-PCR扩增的反应条件为：93~95°C预变性4~6min;93~95°C 变性35~45s;退火温度50~60°C，25~35s;72°C延伸0. 5~1. 5min;20~30个循环， 最后72°C延伸7~lOmin停止反应。
[0030] 优选的，所述SS-PCR扩增的反应条件为：94°C预变性5min ;94°C变性40s;退火温 度55°C，30s;72°C延伸lmin;30个循环，最后72°C延伸7min停止反应。
[0031] 优选的，S4中，所述采用电泳检测SS-PCR扩增产物，判断所述SS-PCR扩增产物是 否含有197bp的特征条带，具体为：
[0032]S4. 1，提取SS-PCR扩增后的5ul SS-PCR产物；
[0033] S4. 2,在含DNA染色剂的1. 5%的琼脂糖凝胶多功能电泳仪上，对所述5ul SS-PCR 产物120V电泳30min ;
[0034]S4. 3,利用凝胶成像分析仪检测电泳后是否扩增出197bp的特征条带。
[0035] SS-PCR产物测序：除了对SS-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检查瓜实蝇特异引物 扩增的特异片段是否与预期的一致外，本发明人还对特异引物的SS-PCR产物进行测序，测 序结果如下：
[0036] 5 ' -TAATTGATTAGTACCTTTAATACTCGGAGCCCCAGATATAGCCTTCCCACGAATAAATAATATAAG ATTTTGACTACTGCCCCCTTCACTTACACTACTTTTAGTGAGCAGTATAGTAGAAAATGGGGCTGGAACAGGTTGAA CTGTTTACCCCCCTCTTTCATCAATTATTGCCCATGGAGGAGCATCTGTTGATC-3'
[0037] 本发明提供的用于快速鉴定具条实蝇的种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法，具 有以下优点：
[0038] (1)种特异性引物对更加特异，只对具条实蝇具有扩增能力，可扩增出一条长度为 197bp的特异条带，而对其近源种无扩增能力，扩增效率更高，结果判断更加直观、便捷；
[0039] (2)PCR检测技术操作简单、快速、高效，一般可在8个小时内完成检测与鉴定，传 统形态学鉴定中，需要饲养15天得到成虫再进行鉴定；可见，本发明大大缩短了具条实蝇 的鉴定周期；
[0040] (3)本发明提供的种特异性引物对，具有较高的灵敏度，DNA浓度检出限为 2. 889X10 4ng/uL，具有较高的实用价值，可以快速、准确、特异性地检测出具条实蝇的各个 虫态甚至残体，具有检测范围大的优点。
[0041]可见，本发明所建立的SS-PCR快速鉴定具条实蝇的方法，具有快速简便、特异性 尚、灵敏度尚等优点，可以在8小时之内完成具条实绳的鉴定，能够满足口岸检验检疫快速 通关的要求。
【附图说明】
[0042] 图1为比较例一提供的通用型引物LC01490和HC02198对提取的实蝇DNA模板进 行质量检测的结果图；
[0043] 图2为比较例一提供的引物JF190和JR386的种特异性验证结果图；
[0044] 图3为比较例三提供的引物JF190和JR386的种特异性验证结果图；
[0045] 图4为试验例一提供的引物JF190和JR386的灵敏度验证结果。
【具体实施方式】