us trifoliate)中PtFLC编码的氨基酸序列同源性最高，为60.76%ο进化系统树结果也显示荔枝的FLC蛋白与枳(Poncirustrifoliate)的PtFLC蛋白同源性最高，亲缘关系最近；其他亲缘关系较近的依次为美洲葡萄(Vitis labrusca)、酿酒葡萄(Vitis vinifera)、和白桦(Betula platyphylla)等；而与小叶杨(Populus simonii)和大豆(Glycine max)中的FLC蛋白遗传距离比较远(图2B)0
[0034]实施例2 LcFLC基因在‘妃子笑’荔枝中的表达分析 LcFLC基因在‘妃子笑’蒸枝中的表达分析采用Real-Time PCR反应进行，具体实施方案如下。
[0035]1.实验材料为分析LcFLC基因在荔枝花芽分化过程中的表达情况，选取荔枝8个不同部位和不同的生长时期的样品RNA用作分析，不同部位的样品如下:成熟叶I (10月份)、成熟叶2 (2月份)、幼叶I (10月份)、幼叶2 (2月份)、叶芽、花芽、花穗和韧皮部。不同的生长时期的样品为自2012.10.22起每隔3周采取‘妃子笑’荔枝成花过程的末次枝梢成熟叶片和顶芽。
[0036]2.定量引物设计根据克隆的得到的基因序列，参照Real-time PCR引物的设计的一般原贝IJ，用Primer 5.0设计特异引物，正向引物QLcFLC-F:5’ -CTGCCTGTTGGATGTGCT-3’，反向引物 QLcFLC-R:5’ - TGGAATCAATAGTGACCCTC -3’。
[0037]3.Real-Time PCR 反应 Real-Time PCR 利用 ABI 7500 Real-Time PCR 检测系统进行。反应体系按照Real-Time PCR Master Mix(T0Y0B0，Japan)说明书，反应体积为20.0 mL。反应结束后通过熔解曲线鉴定产物的特异性。内参基因选择表达稳定性良好的荔枝Actin基因(HQ615689)。采用2 AA CT法进行基因相对表达量数据分析，计算出LcFLC的表达水平。以上所有实验每个样品均设3次重复，用ddH20为阴性对照。
[0038]4.LcFLC在‘妃子笑’荔枝中的表达分析 LcFLC的相对表达量在10月份的幼叶和成熟叶片均保持了较高水平，而在2月份采的幼叶和成熟叶片中均有不同程度的下降，在叶芽和花芽中水平相对更低，在花穗和韧皮部中几乎不存在(图4)。从图4基因表达规律可以看出，在顶芽组织中，整个成花过程不同阶段LcFLC基因表达量始终维持在一个相对稳定的低水平。而在成熟叶片中，LcFLC的表达量开始维持在一个较高的水平，在低温来临后表达量开始迅速下降；在第8周左右达到最低值，比低温来临之前下降了 25倍左右；之后一直维持在一个较低的水平直至成花过程完成。以上结果表明的LcFLC基因的主要在成熟叶中表达，并受到温度的影响，并与成花进程密切相关。
[0039]实施例3 构建含LcFLC基因的植物表达载体，经农杆菌注射法转入本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中，进一步分析LcFLC基因的亚细胞定位。
[0040]1.载体构建本实验使用的是经过部分改造(用GFP代替pBI121中的⑶S基因)的PBI121载体，简称为pBI121-GFP载体(如图5A)。选取Xba I和Sma I两个酶切位点进行酶切，然后电泳检测并切胶回收相应大小的片段。再使用In-fus1n ? HD Cloning Kit连接酶(Clontech)将得到的目的基因连接到pBI121_GFP线性载体中。扩增带重组接头的目的基因引物为 LcFLC-GFP-F:GGACTCTAGA GGATCCATGGGCCGGAGGAAGTTGCAG，LcFLC-GFP-R:GATCGGGGAA ATTCGAGCTCCTATTTTAGCAAGGAAAGGG0 连接体系为:In-Fus1n 改造的目的基因I yL，酶切后的载体I μ L，In-Fus1n酶I yL，加水至5 μ L。混匀后，50°C孵育15 min。In-fus1n连接酶的具体原理及方法详见说明书。
[0041]2.质粒转化及农杆菌转化取2 μ L连接产物用热激法转化至大肠杆菌，转化后活化菌株挑单克隆用PBI121-GFP通用引物进行PCR检测目的基因是否正确转入载体中。并取正确的菌液100 μ L送华大基因公司测序，以验证质粒中是否含有目的基因。再将测序正确、返还的质粒取5 μ L通过冻溶法将其转化农杆菌ΕΗΑ105菌株感受态细胞。挑取单菌用目的基因引物检测，确认重组质粒是否转入到农杆菌中。
[0042]3.本氏烟草注射及观察注射使用的烟草品种为本氏烟草(Nicotianabenthamiana)。23°C、长日照培养一个月，注射前先黑暗处理2 h，再光照30 min，以利于注射。取50 μ L新鲜的农杆菌菌液，加入700 μ L YEP (50 mg.L 1 Rif和100 mg.L 1 Kan)培养基，过夜培养；4000 rpm离心3 min,收集菌体；用MMA重悬液重悬菌体，调整菌液浓度为0D=1.0，室温放置2 h;用I mL注射器注射烟草叶片背面，做好标记。正常培养2天后，用荧光显微镜观察并拍摄照片。结果显示PBI121-GFP空载体对照产出的GFP绿色荧光分布于整个细胞中，呈组成型表达；而在整合有pBI121-LcFLC-GFP融合蛋白的细胞中，GFP绿色荧光仅分布在细胞核中，结果表明LcFLC基因仅定位于细胞核中(图6)。
[0043]实施例4 构建含LcFLC基因的植物超表达载体，经花粉管通道法转入拟南芥，进一步验证AcFT基因的功能。具体构建方法如下。
[0044]1.载体构建及转化实验选择BamH I和Sac I两个酶切位点，将目的基因连接替换⑶S基因。设计上游引物带有BamH I酶切位点和下游引物带Sac I酶切位点的基因特异性植物表达载体构建引物，用于扩增基因的编码区。
[0045]LcFLC-GUS-F: CACGGGGGACTCTAGAATGGGCCGGA GGAAGTTGCAG，
LcFLC-GUS-R:TCCTTTACCCATCCCGGGTTTTAGCAAGGAAAGGG TAGCC0
[0046]使用In-fus1n ? HD Cloning Kit连接酶将LcFLC基因连接到pBI121载体上，获得构建好的35S启动子驱动的LcFLC基因的植物表达载体，命名为pBI121-LcFLC。通过冻溶法将其转化农杆菌EHA105菌株感受态细胞。
[0047]2.拟南芥的转化本实验采用农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法。将正确的农杆菌菌液扩大培养至细菌0D600值大于2.0时，收集细胞并悬浮于大约3倍体积的渗透培养液，将处于盛花期拟南芥小心地反扣在渗透液中，让其花蕾完全浸入农杆菌悬浮液中大约30 S0然后避光培养24h后将植物放置在适宜的条件下培养至种子成熟，分批采集种子后进行下一步的筛选处理。
[0048]3.转基因拟南芥种子的筛选及PCR检测在无菌条件下，将种子消毒后在含有Kan的固体培养基上筛选获得抗性的阳性植株，转移至新的基质中，放置在光照培养室，21°C、长日照(16h:8h)条件下继续培养。待植株长出较多叶片后，每棵拟南芥植株采集I个叶片，分别对转基因植株进行PCR鉴定。根据电泳结果，除去假阳性植株，待阳性植株成熟后，收集种子，37°C烘干，即为TO代种子。然后继续筛选TO代种子，获得阳性植株后，收集到Tl代种子，随后将Tl代种子播种，得到T2代植株，用于观察表型。同时，播种哥伦比亚野生型作为阴性对照。从转基因拟南芥的表型可以看出(图7)，该35S::LcFLC株系均呈现营养生长期延长和开花时间延迟的现象，转基因植株在长日照条件下比野生型成花时间要晚10天左右，莲座叶的数目也有所增加。这些结果说明LcFLC具有延迟开花的功能，是蒸枝开花过程中的抑制基因。
[0049]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种从荔枝中分离得到的成花调节基因LcFLC基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID N0.1 所示。2.根据权利要求1所述的LcFLC基因，其特征在于:所述LcFLC基因编码的氨基酸序列，如SEQ ID N0.2所示，其含有MADS家族典型的结构域。3.根据权利要求1或2所述的LcFLC基因，其特征在于:所述LLcFLC基因编码氨基酸同源性与枳中PtFLC编码的氨基酸序列同源性为60.76%ο4.根据权利要求1所述的LcFLC基因，其特征在于=LcFLC基因定位在细胞核中。5.根据权利要求1所述的LcFLC基因，其特征在于:所述LcFLC基因在荔枝成熟叶片、幼叶、叶芽、花穗和韧皮部中均有表达，其表达量顺序依次为:10月份幼叶> 10月份成熟叶片〉2月份幼叶〉2月份成熟叶片〉叶芽〉花芽〉花穗〉韧皮部。6.根据权利要求5所述的LcFLC基因，其特征在于:荔枝叶片中，所述LcFLC基因的表达量在低温诱导后开始迅速下降，8周时达到最低值，并一直维持在较低水平直至开花；在顶芽中，所述LcFLC基因的表达量一直维持在较低水平。7.根据权利要求1或2所述的LcFLC基因，其特征在于:所述LcFLC基因在延迟或抑制植物开花时间方面的应用。8.一种权利要求1或2中所述的LcFLC基因在调节拟南芥开花中的应用，其特征在于:所述LcFLC基因与pBI121载体相连后得到重组质粒，通过冻融法转化农杆菌，经花粉管通道法转化拟南芥后，抑制拟南芥平均开花时间延迟10天。
【专利摘要】本发明公开了一种从荔枝中分离得到的成花调节基因LcFLC及其应用，属于生物基因领域。本发明具体公开了LcFLC基因的核苷酸序列、克隆方法、含有该基因的亚细胞定位、该基因在荔枝不同组织部位的时空表达特征，该基因具有延迟植物开花时间的功能。本发明首次从分子生物学的角度来初步了解荔枝的成花诱导机理，为以后通过目的基因在荔枝中的过量表达或抑制其表达来调节开花时间打下基础，对于利用基因工程来选育荔枝新品种有着重要的意义。
【IPC分类】C12N15/84, A01H5/00, C12N15/29
【公开号】CN105112427
【申请号】CN201510612144
【发明人】魏永赞, 张红娜, 石胜友, 李伟才, 刘丽琴, 舒波
【申请人】中国热带农业科学院南亚热带作物研究所
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月24日