一种AaTSW2基因启动子及其应用与制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种基因启动子及其应用与制备方法。
【背景技术】
[0002] 青蒿（ArtemisiaannuaL.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素是从其地上 部分分离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治 疗疟疾药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前，世界卫生组织推荐的最有效 的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法（ACTs)。目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地 上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低（〇. 01 % -1 % )，使得这种药物的大规模商业 化生产受到了限制。
[0003]AaTSW2是从青蒿中分离得到的一个WRKY类的转录因子。在青蒿植株中超表达 AaTSW2可以显著提高青蒿中青蒿素及二氢青蒿酸的含量，表明该基因在青蒿素生物合成途 径中具有重要的调节作用。AaTSW2在叶片发育初期及不同组织部位中的表达谱与青蒿素合 成途径中腺毛特异性表达的基因ADS、CYP71AV1和DBR2均具有较高的相似性。因此，该基 因的启动子也极有可能在腺毛中特异性表达。由于青蒿素是在青蒿的油性腺毛中合成，因 此，克隆得到青蒿腺毛特异性的启动子对青蒿素代谢工程具有较为重要的意义。在青蒿基 因工程研究中，目前所采用的启动子大多数是组成性的启动子，例如烟草花叶病毒35S启 动子（CaMV35)。这种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，因此极可能会 对植物的正常生长造成一定的负担和危害。
【发明内容】
[0004] 有鉴于现有技术的缺陷，本发明提供了一种AaTSW2基因启动子，其能引导基因在 植物腺毛中特异表达，在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种过程中， 本发明提供的启动子能够特异性地在腺毛组织启动并高效表达外源基因，而且不会对植物 的生长发育造成危害。
[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0006] 本发明提供了一种启动子，为AaTSW2基因启动子，该启动子的核苷酸序列如序列 表中序列1所示。
[0007] 进一步地，该AaTSW2基因启动子的顺式作用元件如附图1所示。
[0008] 本发明还提供了含有该AaTSW2基因启动子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、 重组菌或重组病毒。
[0009] 进一步地，该表达盒由AaTSW2基因启动子、该启动子启动转录的目的基因和终止 子组成。
[0010] 进一步地，该重组载体为pCAMBIA1391Z-AaTSW2,融合了AaTSW2基因启动子 与gus报告基因，如序列表中序列1所示的DNA片段通过PstI和BamHl酶切位点插入 PCAMBIA1391Z载体。
[0011] 进一步地，该重组菌为经pCAMBIA1391Z-AaTSW2载体转化的根癌农杆菌。
[0012] 本发明还提供了该AaTSW2基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物 的基因工程育种中的应用。
[0013] 优选地，所述代谢产物为青蒿素。
[0014] 本发明还提供了一种AaTSW2基因启动子的制备方法，包括以下步骤：
[0015] 步骤一、培养青蒿无菌苗；
[0016] 步骤二、使用PCR技术克隆启动子基因组序列PAaTSW2 ;
[0017] 步骤三、分析该启动子上的顺式作用元件，确定AaTSW2基因启动子的类型；
[0018] 步骤四、将该AaTSW2基因启动子连入pCAMBIA1391Z载体；
[0019] 步骤五、将构建好的载体pCAMBIA1391Z-AaTSW2载体转化根癌农杆菌；
[0020] 步骤六、将带有pCAMBIA1391Z-AaTSW2载体的根癌农杆菌转化青蒿；
[0021] 步骤七、使用PCR技术检测步骤六中获得的转基因植株；
[0022] 步骤八、确定启动子所引导的gus报告基因在植株中的表达部位。
[0023] 优选地，步骤4中扩增AaTSW2基因启动子的引物为：
[0024]上游引物-CCCTGCAGAGAATAACCCCTTACCTTTTTGT
[0025]下游引物-CCGGATCCGGAGAGAGAAAAAAGATGTAGAAACG〇
[0026] 本发明的有益效果在于：本发明提供的AaTSW2基因启动子，可特异性地在腺毛组 织启动并高效表达外源基因，并且不会对植物的生长发育造成危害，能广泛应用于利用植 物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。
[0027] 以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和 技术效果。
【附图说明】
[0028] 图1为AaTSW2基因启动子区域的顺式作用元件结构图；
[0029] 图2为转基因青蒿植株的PCR阳性检测结果图；
[0030] 图3为利用AaTSW2基因启动子与gus基因融合的载体pCAMBIA1391Z-AaTSW2转 化青蒿后，所获得的转基因青蒿中的⑶S组织染色图。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0032] 下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 分子克隆：实验室手册见NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress的1989年版 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0033] 本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄； 根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008, 28 (3) :38-43》文 献中公开。根癌农杆菌EHA105,质粒pCAMBIA1391Z可通过公开市售的商业渠道取得，如可 以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambarl。
[0034] 本实施例涉及AaTSW2基因启动子的获得，具体包括如下步骤：
[0035] 步骤一、培养青蒿无菌苗
[0036] 青蒿种子用体积分数为75%的乙醇浸泡11^11，再用20%(?八）的似(：10浸泡 20min后，无菌水冲洗3次~4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培 养基上，25°C、16h/8h(light/dark)光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗。
[0037] 步骤二、PCR法克隆启动子基因组序列
[0038] 本实施例采用PCR法克隆AaTSW2基因启动子序列，具体步骤如下：
[0039] 1、基因组DNA提取
[0040] 用CTAB法提取青蒿基因组总DNA，取小片青蒿嫩叶于1. 5mL离心管中，加入600yL CTAB提取液，60Hz振荡研磨100s;之后于70°C加热40min，加入等体积的氯仿：异戊醇 (24:1)，轻柔颠倒混勾乳化lOmin;10000rpm/min离心lOmin;取上清于新的离心管中，加入 等体积异丙醇，颠倒混勾，12000rpm/min离心lOmin;弃上清，加入lmL75%乙醇清洗lOmin， 12000rpm/min离心lOmin;弃上清，吸干乙醇，当乙醇完全挥发后，加入40yL水溶解。
[0041] 2、PCR扩增
[0042] 以所提取的总DNA为模板，根据AaTSW2基因启动子序列设计基因特异性引物（表 1所示），通过PCR从总DNA中扩增AaTSW2基因启动子，并测序。
[0043] 表1AaTSW2基因启动子引物
[0044]
[0045] 步骤三、分析启动子上的顺式作用元件，确定AaORA基因启动子的类型
[0046] 本发明中得到的AaTSW2基因启动子的序列长1303bp。为了寻找启动子上的顺式 作用元件，用PlantCARE(http://bioinform