视网膜色素上皮细胞上皮－间充质转换模型及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞模型，尤其是涉及一种视网膜色素上皮细胞上皮一间充质转换模型及其应用。
【背景技术】
[0002]增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是导致孔源性视网膜脱离手术失败的最主要的原因，因其难治性与复发性一直是各国学者研究的热点，PVR的发生率是5% -20%。PVR属于增生性疾病。PVR的基本病理过程是视网膜出现裂孔之后，血一视网膜屏障破坏，玻璃体中蛋白质和活性介质(如transforming growthfactor(TGF)-β , and fibroblast growth factor(FGF))释放，视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial，RPE)暴露，与光感受器接触丧失，RPE游离、移行，细胞因子刺激RPE增殖，细胞表型发生改变，分泌多种炎性因子如白细胞介素-1、_2(IL-1，IL-2)，单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)，肿瘤坏死因子(TNF)等，趋化胶质细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等浸润，这些细胞通过旁分泌和自分泌大量细胞因子，如肝细胞生长因子(hepatocytegrown factor, HGF)、血小板源性生长因子(platelet derived growth factor, I3DGF)、转化生长因子(transfer growth factor.TGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor, VEGF)等，然后联合胶原等细胞外基质(extracellular matrix，ECM)、纤维连接蛋白共同刺激RPE细胞、成纤维细胞等发生分裂、增殖，最后在视网膜表面或玻璃体内形成增生膜，RPE正是增生膜的主要细胞成分。最终由于增生膜的收缩导致牵拉性视网膜脱离，诱发PVR证实。
[0003]目前已发现的与PVR相关的细胞有5种:RPE、Muller细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和神经胶质细胞。在PVR的早期，发挥主要作用的是RPE细胞和成纤维细胞，在后期，发挥作用的细胞发生了改变，由成纤维细胞发挥主要作用，偶尔可见RPE细胞，mvller和胶质细胞则是在后期负责牵拉视网膜脱离的感受器细胞。因其基本病理过程归因于RPE细胞发生了上皮-间充质细胞转换(epithelial-mesenchymal transit1n，EMT)的转变，进而移行、增生而形成增生膜，并成为增生膜的主要细胞成分，所以RPE是PVR形成过程中最重要的细胞。
[0004]Dunn证实RPE细胞(ARPE-19)具有活体内RPE细胞所特有的结构和功能特点。因此，可用于体外实验。
[0005]EMT转化的机制多种多样的，但是它们都有两个共同的特征，一是通过各种信号通路使细胞间的连接减弱，二是使上皮细胞表型发生转变，获得间质细胞表型，通常转为成纤维细胞和肌成纤维细胞。在EMT的过程中，上皮细胞失去了它的极性和细胞间的连接，失去了它的相关的表型而获得了间质细胞和类似间质细胞的可以移动和侵入的能力，导致细胞本身周围的细胞相脱离、迀移，远离原来的位置，而不再是连接紧密的不可移动的上皮细胞。目前已有研究表明，在诱导人类RPE细胞EMT的过程中会导致一些基因(如TGF-β 1、n-cadherin等)的表达的上调，抑制这些基因的表达也会使EMT的发展受到限制，在有PVR的患者的视网膜前膜可以检测到这些基因的表达。
[0006]根据已有的文献报道，在RPE发生EMT过程有5条信号通路被激活:玻璃体内容物介导的TGF- β I通路、Wnt通路、STAT通路、MAPK通路、Notch通路。如果对RPE发生EMT早期事件进行干预，早期激活的信号通路进行阻滞，将对预防治疗PVR提供了新的策略。
[0007]目前，已有的ARPE19脱分化的细胞模型有两种，一种为TGF-β I和玻璃体共同诱导；另一种为采用EGTA直接诱导，也有用TGF beta2诱导。这三种细胞模型都因其实验条件复杂、难以控制、重复率不高等缺点导致应用率较低。
[0008]联合TGF- β I和玻璃体共同诱导RPE细胞的EMT转变是最早的方法，这个模型先后分别用TGF-β I和玻璃体处理RPE细胞，通过检测磷酸化的smad-2，smad-3，smad-4或核内定位smad-2，smad-3, smad-4来表明玻璃内有TGFP样活动。结果证实:(I)玻璃体处理的RPE细胞表现出明显的纺锤样改变和增强的能动性和迀移能力，但因玻璃体诱导的能动性和迀移能力的增加又依赖于TGF-β的存在，抑制TGF-β可以减弱但因玻璃体诱导的能动性和迀移能力的增加；(2) TGF-β处理的细胞在形态学上弱于玻璃体处理时的纺锤样改变，没有显示出能动性和迀移能力的改变，向间质细胞分化的基因(a -SMA和CTGF)的表达可以因TGF-β的刺激而上调，却被玻璃体的刺激而下调；(3)SB431542作为TGF-β I通路的抑制剂，单独存在时对RPE细胞的形态没有影响，可以减弱因TGF- β的处理引起的EMT样形态学改变，不能阻止玻璃体诱导引起的RPE细胞在形态学上的EMT改变，甚至有促进的作用，但降低了玻璃体处理引起的的的能动性和迀移能力的增加。所以，从EMT相关基因(α-SMA和CTGF)的表达上，TGF-β I和玻璃体存在相互抑制和促进共存在这个模型内，造成了建模时TGF-β I和玻璃体成分的剂量难以控制，难以使其恰巧处于平衡状态；但从形态学、能动性和迀移能力上，两者又必须共存。因此，这个细胞模型的重复性较差、条件难以控制。
[0009]采用EGTA直接诱导RPE细胞的EMT转变是目前已知的第二种方法。该模型用2mMEGTA处理RPE细胞48小时，打断了细胞间连接后，发现边缘的细胞具有了能动性和迀移能力，形态学上也向着间质细胞样发展，但缺点在于中央的细胞间连接很难被破坏，因此没有发生EMT转变。因此这个细胞模型也不能很广泛的被应用。
[0010]因此建立简便、稳定、易控制的模拟PVR的模型极为重要。
【发明内容】
[0011]本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种简便、稳定、易控制的视网膜色素上皮细胞上皮一间充质转换模型及其应用。通过本模型的建立，对其机制进行深入的研究，通过干预该模型激活的信号通路或特殊的细胞因子，有效地抑制RPE的EMT过程，为人类预防治疗PVR提供新的途径和方法。
[0012]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0013]—种视网膜色素上皮细胞上皮一间充质转换模型:将ARPE-19细胞用胰酶消化后，再转入无血清含N2和非必需氨基酸的DMEM-F12培养基中，并在陪替氏培养皿中培养，即得视网膜色素上皮细胞上皮一间充质转换模型。
[0014]本发明选用的细胞为体外培养的RPE细胞(ARPE-19)，其具有活体内RPE细胞所特有的结构和部分功能特点(不表达RPE65)，可用于体外实验。
[0015]所述的N2在DMEM-F12培养基中含量为Iwt.%，所述的非必需氨基酸在DMEM-F12培养基中含量为Iwt.%。
[0016]所述的非必需氨基酸为市售的含有12种非必需氨基酸的标准添加剂。
[0017]所述的N2与非必需氨基酸都是购自life techonology公司的常规添加剂。N2的货号为 17502-048，life technology，非必需氨基酸货号为 111401ife technology。
[0018]在培养皿中，所述的ARPE-19细胞的密度为0.5 X 17?I X 10 7Cells/培养皿。细胞密度的重要性在于ARPE19发生EMT有密度要求，如果密度太高，EMT过程受到抑制。
[0019]培养设定时间后收集细胞样本或溶于trizol中，通过显微照相、基因芯片、荧光定量PCR、Western blot或ELISA实验方法证实ARPE-19确实经历了上皮一间充质转换。
[0020]上述视网膜色素上皮细胞上皮一间充质转换模型的应用:该模型用于研究视网膜色素上皮细胞发生上皮一间充质转换的分子机制及寻找上皮一间充质转换的干预靶向。
[0021]先在细胞皿中将P-STAT3-TA-LUC报告基因的质粒用Iipofectaminer 2000转染到ARPE-19中，48小时后将细胞转入无血清含N2和非必需氨基酸的DMEM-F12培养基中在细菌皿中培养，分别于12h、24h、36h、48h、72h后收集细胞样本，蛋白裂解后常规BCA蛋白定量，并用Luciferase检测信号传导和转录激活因子3的表达。
[0022]该模型用于研究mir-24对ARPE-19发生上皮一间充质转换时的抑制作用。
[0023]与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果:
[0024]1、本发明模拟RPE发生EMT的两个必备条件:一是细胞间紧密连接破坏，二是RPE脱离Bruch膜。本发明采用消化RPE细胞为单细胞，将分散的单细胞转入无血清含N2和NEAA的培养液中在陪替氏培养皿上培养，RPE在陪替氏培养皿的生长出现典型的EMT病理过程，该方法简单易行、重复性好。
[0025]2、本发明建立的RPE的EMT模型，模拟了增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的发病机制；并通过实验证实在该细胞模型中stat3信