角质细胞和黑素细胞混合培养的方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞培养方法，尤其涉及一种角质细胞与黑素细胞(黑色素细胞)混合培养的方法及其应用。
【背景技术】
[0002]肤色的不同主要取决于皮肤中黑素的数量、大小、类型及分布情况。黑素是一种蛋白衍生物，由表皮中的黑素细胞产生。
[0003]部分皮肤病患者身体各部位出现白斑是由于皮肤黑素细胞缺失、被破坏或无功能，进而影响皮肤色素制造系统引起。如白癜风便是一种常见的后天性限局性或泛发性皮肤色素脱失病，是由于皮肤的黑素细胞消失引起的，其他类似疾病还包括黑痣、黄褐斑、雀斑、太田痣等色素性疾病。这种疾病会对患者生理和心理上造成严重损害。目前的治疗方法包括局部使用皮质类固醇、NB-UVB/PUVA、准分子激光等，但疗效低，并伴随一定副作用。
[0004]其他的治疗上述疾病的方法还包括:1)外科移植技术，如负压吸疱法、刃厚皮片移植、微小皮片移植，但对大面积患者来说存在皮源紧缺问题；2)黑素细胞移植法，如CN102266586B公开的黑素细胞移植涂布载体、CN101892286B公开的黑素细胞培养方法，以及CN100354001C公开的黑色素细胞悬液制剂，均可用于黑素细胞移植，但该方法存在黑素瘤并发风险、均匀度较差的问题，且其最大技术难点在于黑素细胞生长较差，无法在短期内大量扩增。
[0005]另一方面，分离黑素细胞除培养基外无其他特定方法，直接从活体内分离的黑素细胞数量极少，且具有有限的均匀性和增殖能力，因此是毫无效率可言的。进一步，有报告称，当在体外使用刚从表皮层中分离出的黑素细胞时，所述细胞对UVB等的刺激毫无反应，又或与黑色素合成相关的基因的表达会有下降。
【发明内容】
[0006]针对目前黑素细胞体外培养所存在的问题，本发明提供了一种角质细胞与黑素细胞共同培养的方法。
[0007]本发明第一个方面是提供一种用于角质细胞和黑色素细胞的无血清培养基，所述培养基包括:KGM-Gold培养基和KGM培养基。
[0008]其中，在第一个方面所述的培养基中，所述KGM-Gold培养基和KGM培养基相互独立存在。
[0009]本发明第二个方面是提供一种角质细胞与黑素细胞共同培养的方法，步骤包括:
[0010]保留表皮层和至少部分真皮层的皮肤样本，破碎后，进行胰酶冷消化；
[0011]收集沉淀组织，用I型胶原酶进行热消化，收集细胞；
[0012]原代接种，在KGM-Gold培养基中进行；
[0013]传代培养，至细胞汇合，在KGM培养基中进行培养。
[0014]本发明第三个方面是提供一种制备人工表皮的方法，步骤包括:
[0015]保留表皮层和至少部分真皮层的皮肤样本，破碎后，进行胰酶冷消化；
[0016]收集沉淀组织，用I型胶原酶进行热消化，收集细胞；
[0017]原代接种，在KGM-Gold培养基中进行培养；
[0018]传代培养，至细胞汇合，在KGM培养基中进行培养至细胞分化分层；
[0019]收集形成的皮片。
[0020]在一种优选实施例中，所述KGM-Gold培养基中添加有附加因子，所述附加因子可以是选自氢化可的松(hydrocortisone)、铁源、肾上腺素(epinephrine)、牛脑垂体提取物(BPE)、表皮生长因子、胰岛素、抗生素中的任意一种或几种。
[0021]在一种优选实施例中，所述KGM培养基中添加有附加因子，所述附加因子可以是选自KSR(Knockout血清替代物)、角质细胞生长因子、氢化可的松、表皮生长因子、抗生素、铁源中的任意一种或几种。
[0022]其中，所述铁源可以是能够被细胞转铁蛋白受体接受并获取铁元素的物质，如转铁蛋白(transferrin)、以及能够起到相同作用的转铁蛋白替代物中的任意一种或几种。
[0023]其中，转铁蛋白可以是重组转铁蛋白、人源转铁蛋白、动物源转铁蛋白(如牛源转铁蛋白)中的任意一种或几种。
[0024]其中，所述转铁蛋白替代物可以是柠檬酸铁、二甲胂酸铁、葡糖酸铁中的任意一种或几种。
[0025]其中，所述胰岛素可以是重组胰岛素、人源胰岛素、动物源胰岛素(如牛源胰岛素)、以及类胰岛素生长因子。
[0026]其中，所述抗生素可以是选自青霉素(Penicillin)、链霉素(streptomycin)、庆大霉素(Gentamicin)、GA-1000、两性霉素 B (amphotericin B)、Pen/Strep (Penici 11 in-streptomycin)中的任意一种或几种。
[0027]其中，所述角质细胞生长因子如人角质细胞生长因子(HKGS)、KGF-2、rhKGF_2、KGF-1、rhKGF-1中的任意一种或几种。
[0028]其中，所述表皮生长因子如重组人表皮生长因子(rhEGF)、EGF中的任意一种或几种。
[0029]在一种优选实施例中所述角质细胞与黑色素细胞可以是源于同一生物体或不同生物体，也可以是源于同一生物体的不同部位或相同部位。
[0030]所述皮肤样本可以是异体和/或自体皮肤样本，并优选为自体皮肤样本。所述皮肤样本可以是源自胸部、腹部、背部、臀部、四肢等任意一种或几种部位的皮肤。
[0031]在一种优选实施例中，所述活性皮肤样本中，真皮层占初始皮肤样本中真皮层的体积比，优选为15-50%，更优选为20-45%，更优选为25-40%，更优选为30-35 %。
[0032]在一种优选实施例中，表皮角质细胞与黑色素细胞数量比例优选为100: (0.001-80)，优选为 100: (0.01-60)，优选为 100: (0.1-50)，优选为 100: (0.5-40)，优选为 100: (1-30)，优选为 100: (5-20)，优选为 100: (10-15)。
[0033]在一种优选实施例中，所述皮肤样本中，真皮层厚度优选为0.2_4mm，更优选为
0.3-3.5mm,更优选为0.5-3.0mm,更优选为0.8-2.5mm,更优选为1.0-2.2mm,更优选为
1.2-2.0mm0
[0034]在一种优选实施例中，所述传代培养优选为在原代培养第2-8天、优选为3-6天、更优选为4-5天进行。
[0035]在一种优选实施例中，所述胰酶冷消化的时间优选为8-24小时，更优选为10-22小时，更优选为11-20小时，更优选为12-18小时，更优选为14-16小时。
[0036]在一种优选实施例中，所述胰酶冷消化过程中，胰酶质量浓度优选为0.01-0.1 %，更优选为0.02-0.08 %，更优选为0.04-0.07 %，更优选为0.05-0.06 %。
[0037]在一种优选实施例中，所述I型胰酶热消化的时间优选为1-10小时，更优选为
1.5-8小时，更优选为2-6小时，更优选为3-5小时。
[0038]在一种优选实施例中，在KGM-Gold培养基中进行培养的过程中，培养基更换间隔优选为至少12小时，更优选为24小时，更优选为36小时。
[0039]在一种优选实施例中，在KGM培养基中培养1-10天后收集皮片，更优选为2_9天后、更优选为3-8天后、更优选为4-6天后收集皮片。
[0040]本发明的有益效果如下:
[0041](I)本发明方法适合所有人的正常皮肤组织，包括带毛发部位。
[0042](2)本发明方法无需滋养层无需牛血清，可直接铺在预处理过的培养皿或瓶中培养，近似于生理状态的条件培养，消除了异种蛋白的影响。
[0043](3)本发明方法在分离提取时需要表皮并携带真皮，因为黑素细胞主要存在于表皮基底层，且能提取到更多增殖能力强的角质细胞。
[0044](4)本发明方法使用的培养基只针对皮肤角质细胞和黑素细胞的培养，避免了其它细胞的污染。
[0045](5)本发明方法提供了一种表皮细胞与黑色素细胞共培养的方法，并可获得包含功能性黑素细胞且分布均匀的表皮膜片，可在白癜风等色素缺失的皮肤疾病上得到应用。
[0046](6)本发明方法可以由很小面积的自体样本获得大面积的表皮膜片，解决了大面积皮肤患者皮片移植时皮源紧缺问题。
[0047]综上所述，本发明提供的角质细胞与黑素细胞共培养的方法，能够培养成含黑素细胞的表皮用于移植。该方法是在体外进行扩增培养，