一种芽孢杆菌及其高密度培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物发酵工程领域，具体是指一种芽孢杆菌13002及其高密度培养 方法。
【背景技术】
[0002] 凝结芽孢杆菌（Bacilluscoagulans)属能产生芽孢的、杆菌类乳酸菌。革兰氏阳 性菌，代谢类型为兼性厌氧型，有氧条件较无氧条件能够产更多的生物量。菌体呈杆状，芽 孢端生，无鞭毛。最适生长温度为40 °C~50 °C，最适生长pH值一般为6. 6~7. 0,发酵培 养可产乳酸。同时，凝结芽孢杆菌是益生菌领域的潜力股，具备耐高温、耐胆盐、耐酸等抗逆 性，对于部分抗生素和某些有害菌也有一定的抑制能力。近年来，凝结芽孢杆菌已然成为国 内外研究的热点之一，研究的重点在于如何用低廉易获得的培养基获得高密度培养的凝结 芽孢杆菌菌体。而国内对于凝结芽孢杆菌的研究才处于刚起步阶段。
[0003]对于微生物发酵培养来说，高密度培养技术（HCDC，highcelldensityculture) 指的是模拟人体生长环境，使细胞在特定细胞生物反应器中快速增长，从而充分提高菌体 的发酵密度和生物量，或增加特定代谢产物的比生长率的一种培养技术。从广义上讲，凡是 微生物培养至密度较高，活菌数达10 11~10 12CFU/g的均可成为高密度培养；实际上，由于 菌种之间的特性差异，对于生长很慢的微生物，只要增长至较原来提高10倍甚至更高倍数 的时候，便可以视作高密度培养。分批补料培养（fed-batchculture)指在培养的某些阶 段，不定期地添加物料，使菌体及其代谢产物能够持续增长的培养技术；这是目前针对益生 菌进行高密度培养最完善、最经常被使用的方式。
[0004] 申请号为201110169109. 4的中国发明申请公开了"发酵乳酸菌的高密度培养方 法"，是采用促进发酵乳杆菌增殖的专用培养基，并通过添加碱性物质以中和菌体代谢产生 的酸，并适当补糖，克服发酵过程中碳源短缺和产酸抑制菌体生长的问题。但是对培养条件 的优化较少；采用的糖反馈法属闭环控制，较为单一。
[0005] 申请号为201310742351. 5的中国发明申请公开了"一种用于芽孢杆菌的高密度 培养方法及培养基"，适用于地衣芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌的高密度培养，得到的发酵液中 芽孢形成率可在90%以上，芽孢密度最低在120亿/毫升以上。但是没有说明是否适用于 凝结芽孢杆菌，也没有指出芽孢杆菌经高密度培养后达到的具体活菌数。
[0006] 申请号为201410516317.0的中国发明申请公开了"一种植物乳杆菌及其高密度 培养方法"，是通过pH不再降低来判断是否到达发酵终点，同时指出该菌株具有良好的酸耐 受性、胆盐耐受性及抑制常见肠道致病菌生长特性。但是没有采用分批补料培养法，仅靠自 然发酵不足以使菌种高密度培养达到最优水平。
[0007]上述现有技术指出高密度培养的限制因素和解决方法，主要包括：底物、产物或代 谢副产物的负反馈作用；培养条件包括培养温度、pH值、溶氧量等的抑制作用。具体办法 包括添加中和剂控制PH，添加碳源减少底物抑制等等，但仍存在适用范围受限、优化条件不 足、方法选择单一等缺点。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种芽孢杆菌13002及其高密度培养方法。既符合该菌种的 研究趋势，也为该菌种的深入研究及实际应用提供理论基础。
[0009] 本发明的目的通过如下技术方案实现：
[0010] 本发明芽孢杆菌13002,由荔枝汁中分离筛选得到，该芽孢杆菌菌株具有如下性 质：
[0011] (1)形态特征：革兰氏阳性细菌，在一定条件下可产生芽孢，为兼性菌，菌体为杆 状，单个排列，宽约〇? 5~1. 0ym，长约3. 0~5. 0ym。
[0012] (2)生理特征：接触酶、过氧化氢酶、V-P实验、硫化氢都为阳性，能水解酪蛋白、 明胶和淀粉，能利用柠檬酸盐、硝酸盐，不能利用丙酸盐，吲哚实验为阴性，最高生长温度为 65°C;能利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、甘露糖、木糖、乳糖、半乳糖，不能利用鼠李糖。
[0013] 16SrDNA测序结果见核苷酸序列表，测序结果表明该菌株的序列与凝结芽孢杆菌 的同源性达到100% ;同时根据生理生化的结果，鉴定该菌为凝结芽孢杆菌。
[0014] -种芽孢杆菌的高密度培养方法，包括如下步骤：
[0015] (1)将处于对数期生长的芽孢杆菌13002的菌悬液于种子培养基中，进行活化培 养，得到种子培养液；所述种子培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨〇. 2份~1. 0份， 酵母提取粉〇. 1份~〇. 5份，葡萄糖1. 0份~2. 0份，NaCl0. 5份~1. 5份，用蒸馏水定容 至100份，调节pH至6. 0~7. 5,灭菌后冷却即可；
[0016] (2)以体积比2~10 :100的比例，将种子培养液接种于发酵培养基中，进行发酵 培养至16h~36h收集发酵培养液；
[0017] (3)将发酵培养液离心后收集菌泥，用生理盐水清洗后收集菌泥，按保护剂与湿菌 泥体积比3~5 :1，加入菌种保护剂后，混合均匀后，进行干燥，得菌粉。
[0018] 所述菌种保护剂为10%海藻糖生理盐水溶液。
[0019] 所述发酵培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨0. 5份~1. 75份，酵母提取粉 1. 0份~2. 75份，葡萄糖1. 25份~4. 0份，NaCl0. 5份~1. 5份，用蒸馏水或发酵培养基 缓冲液定容至100份，调节pH至6. 0~7. 5,灭菌后冷却即可。
[0020] 所述发酵培养基中细菌学蛋白胨1. 0份，酵母提取粉2. 5份，葡萄糖2. 0份，NaCl 1.0 份。
[0021 ] 所述发酵培养基缓冲液为Na2HP04-柠檬酸、Na2HP04-NaH2P〇dPKH2P04-Na0H缓冲液 中的一种或两种，并用其中的一种或两种以上来调节pH。
[0022] 当发酵至16h~24h时，补充发酵培养基，培养至24h~36h收集发酵培养液。
[0023] 所述发酵培养基的补料速率为0.5gAL?h)~1. 5gAL?h)的恒定速率补料，以 葡萄糖的浓度计。
[0024] 所述种子培养基和发酵培养基的pH均为6. 5 ;所述发酵是在发酵罐中自动发酵。
[0025] 所述发酵培养温度为35°C~55°C。
[0026] 所述种子培养液与发酵培养基的体积比为6 :100 ;发酵培养温度为45°C。
[0027] 所述干燥为真空冷冻干燥、喷雾干燥或流化床干燥。
[0028] 本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
[0029] (1)本发明芽孢杆菌13002高密度培养的培养基，其中，酵母提取粉来源于食用酵 母，富含氨基酸、维生素等多种生长因子，细菌学蛋白胨总氮含量较高，两者协同作用使培 养基能够发挥更好的效果。
[0030] (2)本发明利用缓冲体系来控制pH以促使芽孢杆菌13002进行高密度培养，在该 条件下培养所得的活菌数高达2. 138X109CFU/mL，提高至优化前的1. 73倍，较好地解决了 培养过程产酸抑制菌体生长的问题。
[0031] (3)本发明采用分批补料培养法，在发酵罐中自动发酵，于菌种生长对数末 期，以0. 5gAL?h)的恒定速率添加发酵培养基，最终测得芽孢杆菌13002活菌总数是 3. 095X109CFU/mL，冻干后活菌总数达0. 730X10nCFU/g，既达到了高密度培养的目标，也 较好地克服了培养过程中底物和产物抑制的问题。
[0032] (4)本发明公开的菌株是嗜热菌，在温度35°C~55°C中都能进行生长和发酵，在 高温环境下进行发酵和生长，不容易污染杂菌。
[0033] (5)本发明公开的菌株经急性毒理实验证实是食用安全的，是一株潜在的益生菌， 既可以用于菌粉，也可以用于高光学纯度的L-乳酸的发酵。
[0034] 所述芽孢杆菌（Bacillussp. ) 13002,已于2013年4月8日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.7431。
【附图说明】
[0035] 图1为实施例1中芽孢杆菌13002生长曲线；
[0036] 图2为实施例1中不同耐受温度对芽孢杆菌13002生长影响；
[0037] 图3为实施例1中不同耐胆盐时间对芽孢杆菌13002生长影响；
[0038] 图4为实施例1中不同耐酸时间对芽孢杆菌13002生长影响；
[0039] 图5为实施例1中摇瓶分批补料培养对芽孢杆菌13002生长影响；
[0040] 图6为实施例1中摇瓶和自动发酵罐分批补料培养对芽孢杆菌13002生长影响。
【具体实施方式】
[0041] 为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明 要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。
[0042] 实施例1
[0043] (1)将处于对数期生长的芽孢杆菌13002的菌悬液于种子培养基中，进行连续 2~3次活化培养，得到种子培养液；所述种子培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白 胨1. 0份，酵母提取粉0. 5份，葡萄糖2. 0份，NaCl1. 0份，用蒸馏水定容至100份，用 Na2HP04_NaH2P04缓冲液调节pH至6.5,灭菌后冷却备用；
[0044] (2)以体积比6 :100的比例，将种子培养液接种于发酵培养基中，于45°C进行摇瓶 培养，至24h培养结束，得发酵培养液；所述发酵培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨 1. 〇份，酵母提取粉1. 〇份，葡萄糖2. 0份，NaCl1. 0份，用蒸馏水定容至1