一种具有ace抑制活性的核桃肽及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食源性蛋白深加工技术领域，涉及一种以核桃渣为原料制备具有ACE 抑制活性的核桃肽及其方法。
【背景技术】
[0002] 核桃又名胡桃、羌桃，与扁桃、腰果、榛子并列为世界著名的四大干果，具有很高的 食用价值，在国外，核桃被称为健脑之果、长寿之果、美容之果。核桃的药用价值也很高，中 医应用广泛。我国医学认为核桃性温、味甘、无毒，有健胃、补血、润肺、养神等功效。核桃是 公认的优质植物蛋白资源，核桃蛋白的营养价值与动物蛋白相近。因此，为了很好地开发核 桃资源，对核桃蛋白功能性质的研究极为重要。核桃仁营养丰富，根据对核桃仁成分的分 析，核桃中除油脂占到65% -70%外，核桃优质蛋白质含量占到14% -17%，其可消化率达 85%。核桃蛋白质还含有18种氨基酸，除含有人体必需的8种氨基酸外，精氨酸、谷氨酸、 组氨酸和酪氨酸的含量也比较高，高的精氨酸摄入量和较低的赖氨酸与精氨酸比值均可有 效降低动脉粥样硬化和冠心病的发生。制备生物活性肽的方法主要包括化学水解法和生物 酶解法。生物酶解法与化学水解法相比，具有反应条件温和、氨基酸受损较少、可以获得特 定肽段的优势。研究表明：采用适当的蛋白酶对食源性蛋白进行水解，可获得具有一定生物 活性的肽，其活性主要包括抗氧化、提高免疫力、降血压活性等。降血压肽其来源很广泛，有 大豆、玉米、小麦、水产、乳清蛋白等等，目前已从牛乳蛋白、玉米蛋白、大豆蛋白、腐乳、丝蛋 白、豌豆蛋白、胶原蛋白、蜂王浆、蛋黄及鱼贝类蛋白等食物蛋白的酶解产物或发酵制品中 分离得到了各种ACE抑制肽，然而以核桃仁为原料制备的低分子肽制品却寥寥无几。
[0003] 核桃一直被作为一种益智类食品深受消费者的青睐，开发核桃蛋白肽又可以增加 产品附加值。另外，我国是核桃生产最大的国家，核桃制油后废弃了大量的核桃渣，采用核 桃渣为原料开发核桃蛋白肽，原料非常丰富，价格低廉，可满足大规模工业化生产，同时减 少了资源的浪费，提高了核桃制品的附加值，有效地弥补了核桃深加工的欠缺。所以，研究 开发核桃生物活性肽具有广阔的前景。
[0004] 目前已有发明专利涉及酶解核桃蛋白制备核桃降血压肽的技术，但均从不同方面 体现出一定的不足：（1)这些技术制备的核桃活性肽进行纯化后的氨基酸序列鉴定，这对 于研究者理解产品的生物学机制具有一定的限制；（2)有的产品活性较低、有的产品纯度 较低，对于活性肽的深度开发应用具有一定的限制性；（3)有的技术并未涉及最终产品的 干燥技术，这对于实现产品的工业化生产具有一定的障碍；有的技术使用的干燥技术为传 统的喷雾干燥技术，对于活性肽产品的活性可能具有一定的影响。
【发明内容】
[0005] 根据目前核桃蛋白肽开发利用中存在的技术问题，本发明提供了一种具有ACE抑 制活性的核桃肽及其制备方法。本发明对于核桃蛋白产品多样化、核桃生物活性肽在功能 性食品、保健食品或者药品中的开发利用具有重要的意义。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007] -种具有ACE抑制活性的核桃肽的制备方法，以核桃渣为原料，选取合适的蛋白 酶、根据最佳酶解工艺制备核桃降血压肽粗产品、采用膜技术耦合层析技术对核桃降血压 肽进行精细化制备、并采用高效液相色谱法进一步纯化制备、并采用真空冷冻干燥技术或 者低温喷雾干燥技术进行最终产品的制备。具体制备步骤如下：
[0008] 一、核桃渣前处理：取压榨油后的核桃渣（也称为核桃柏）进行粉碎，过30~100 目筛子，得粉碎核桃渣样品。
[0009] 二、核桃粗蛋白的制备：取粉碎后核桃渣与3~5倍重量的水混合，浸泡10~30 分钟后制浆，然后用lmol/LNaOH将其pH调至7. 5~9. 0，在45~65°C水浴中搅拌0. 5~ 2h，3000~6000rpm离心lOmin，去除油层提取上清液，将上清液的pH调到4~5,静置30~ 60min后，4000~8000rpm离心15~30min，采用适量去离子水洗涤至中性（pH7. 0)，获得 核桃粗蛋白，用95 %的乙醇洗涤两次，冷冻干燥备用。
[0010] 三、活性肽的酶解制备：⑴配制质量百分比为3~5%的核桃蛋白溶液，充分搅 拌，调节pH为1.2~2.0 ; (2)按照质量百分比为2~3%的添加量加入胃蛋白酶，35~ 40 °C水浴1~2h，反应过程中调控体系pH保持在1. 2~2. 0 ; (3)反应结束后，调pH至4. 5， 4000~8000rpm离心5~lOmin，取上清液，调pH至7. 0,经过3-5kD的再生纤维素膜过滤， 取穿透液保存在4°C环境中备用。
[0011] 四、核桃活性肽的初步纯化制备：（1)首先采用凝胶过滤层析纯化：取超滤后的核 桃多肽用超纯水配成10~20mg/mL，经0? 1或者0? 22ym膜过滤，样品经SephadexG-15凝 胶层析柱分离，装载的样品体积为柱体积的2~10% (根据样品浓度调整），洗脱溶液采用 超纯水，洗脱速度为2~5mL/min，洗脱液体积为柱体积的1~3倍，检测波长为220nm。采 用高效液相色谱法进行活性检测，对ACE具有较高抑制活性的即视为具有较高活性。收集 活性较高的组分并采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩。（2)再采用离子交 换层析进行纯化：浓缩后的样品进一步采用强阴离子交换层析HiTrapMonoQ进行纯化。 该层析柱预先用pH为8. 0的Tris-HCl溶液平衡（缓冲溶液A)，缓冲溶液B为含有0. 5~ lmol/LNaCl的缓冲溶液A。装载的样品体积为柱体积的20%~50% (根据样品浓度及填 料的饱和吸附量进行调整），采用两步线性洗脱的方式进行洗脱，采用含有30~50%缓冲 溶液B的混合溶液线性洗脱10~20倍柱体积，再用100 %缓冲溶液B线性洗脱5~8倍柱 体积，洗脱流速0.5~2mL/min。检测波长为220nm。采用高效液相色谱法进行活性检测， 对ACE具有较高抑制活性的即视为具有较高活性。收集活性较高的组分并采用截留分子量 为500D的再生纤维素膜进行浓缩。
[0012] 五、核桃活性肽的精致纯化制备：采用高效液相色谱法对核桃活性肽进行精致纯 化：将由离子交换层析纯化得到的具有较强活性的样品按照重量体积比为1~5 : 1(W/V) 溶于含有〇. 1~〇. 2 %三氟乙酸（TFA)的超纯水中，采用0. 1~0. 22ym滤膜过滤。流动相 A为0. 1~0. 2%TFA-H20,流动相B为0. 1~0. 2%TFA-CH3CN，所用洗脱溶剂需采用0. 1~ 0. 22ym滤膜过滤并超声处理，防止色谱柱中产生气泡。待基线平稳后开始上样，上样量为 50~100yL。色谱柱为硅胶烷基键合相C18柱（9. 4mmX250mm，胶粒大小5ym，孔径大小 为300目）。采用二元流动相梯度洗脱系统，在30~50min内，流动相B在洗脱剂中的含量 从0%到100%按线性关系增长。系统流速0.5~3.511117111111，检测波长21511111，室温检测。 收集各组分进行活性检测，其中活性最高组分经过多次制备收集。
[0013] 六、核桃活性肽的干燥：高活性组分收集后，采用截留分子量为500D的再生纤维 素膜进行浓缩并通过真空冷冻干燥法进行核桃活性肽的制备，控制冷阱温度-73~-40°C， 真空度0. 01~0. 5mbar，时间3~24h，制得产品即为具有ACE抑制活性的核桃肽产品； 或者通过低温喷雾干燥进行，活性多肽溶液的固形物含量范围为15~40%，真空度达 到-0. 01~-0. 06MPa，进风温度为95~145°C，进料速度根据机器情况进行调整，物料温度 控制在30~60 °C。
[0014] 相关检测方法：
[0015] ⑴多肽（蛋白质）含量测定：
[0016] 采用凯氏定氮法测定各类样品中多肽（蛋白质）含量。
[0017] (2)蛋白质提取率计算：
[0018]
[0021] (4)样品活性测定：
[0022] 高效液相色谱法测定肽活性：取不同浓度的溶液10yL，加入5yLACE溶液，在 37°C条件下保持5min后加入50yLHHL溶液开始反应，在37°C条件下反应30min后加入 85yLI. 0m〇L/LHC1中止反应，得到反应液。将该反应液用0. 45ym滤膜过滤后用于HPLC 分析。同时用10yLpH8. 3的硼酸缓冲液替代溶液制备反应液，作为空白对照组。色谱条 件：zORBAx300SB-C18分析用色谱柱（4. 6mmi.d.X150_，填料粒径为5ym)，柱温25°C， 流动相为乙腈-超纯水（体积比为25 : 75,各含0.05% (体积分数）三氟乙酸及0.1% (体积分数）三乙胺），流速0. 5mL/min，检测波长228nm，自动进样，进样量5yL。对应的实 验结果见表1。
[0023] 不同浓度的经过纯化的核桃降血压肽对ACE酶的抑制率情况