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【专利说明】具有右旋糖酐酶活性的多肽与编码它们的多核苷酸
[0001 ] 对序列表的引用
[0002] 本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
[0003] 发明背景 发明领域
[0004] 本发明涉及具有右旋糖酐酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉 及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。
[0005] 相关技术说明
[0006] 右旋糖酐（具有高分子量的多糖和主要是具有大部分a-1-6糖苷键的直链的葡 萄糖聚合物）是非常不希望的杂质，该杂质在甘蔗压榨机和甜菜压榨机以及炼糖厂中将导 致严重的加工问题。
[0007] 右旋糖酐的存在对榨糖机流量的影响有许多并且是变化的（艾美瑞（Imrie)FKE， 蒂尔伯里（Tilbury)RH.(1972)?甘鹿中的多糖及其产物（Polysaccharidesinsugarcane anditsproducts)?糖技术综述（SugarTechnologyReviews)1972 ;1:291_361;劳（Rauh) JS，卡迪希（Cuddihy)JA，欧佩莱卡（Opelka)MJ.(1999)。分析糖工业中的右旋糖酐：工厂中 的右旋糖酐和新分析技术的综述（AnalyzingDextranintheSugarIndustry:AReview ofDextranintheFactoryandaNewAnalyticalTechnique).第30 次两年一次的 会议，美国甜菜技师协会（AmericanSocietyofSugarBeetTechnologists)，1999,奥 兰多（Orlando)，FL，USA.;埃格尔斯顿（Eggleston)，G，蒙日（Monge)A，蒙特斯（Montes) B，斯图尔特（Stewart)D(2009)，右旋糖酐酶在甘鹿工厂中的应用：克服实际（Application ofdextranasesinsugarcanefactory:Overcomingpractical)，糖技术（SugarTech) (2009) 11(2) :135-141),在糖工业：粗糖工业和精糖工业上带来了重大损失。右旋糖酐是 从包含于原料中的鹿糖不可逆地形成的（卡迪希（Cuddihy)JA，劳（Rauh)JS，波罗（Porro) ME.(1998) ?用糖加工化学药品改善糖回收（Improvingsugarrecoverywithsugar processchemicals)?米德兰研究实验室公司（MidlandResearchLaboratories,Inc.)， 1998)。右旋糖酐污染的最显著的影响是在糖加工流的粘度上。由于原汁中的右旋糖酐 在倾析器中充当抑制凝固相的保护性胶体，其造成了较差的澄清（拉夫诺（Ravno)，A.B.， 和B.B.伯彻斯（Purchase)，2006,在南非的糖业中对右旋糖酐的处理（Dealingwith dextranintheSouthAfricansugarindustry)，国际糖业杂志（InternationalSugar Journal)，108:255-269)。结果是，在由具有细微悬浮物质的此类汁做成的糖中，预期更多 的颜色和灰分。由于存在这种悬浮物质，炼糖厂在导致吞吐量降低的过滤速度方面可能 面临巨大的挑战（多纳文（Donavan)，M，1993,原糖质量（Rawsugarquality).对精炼厂 的影响（Theeffectontherefiner)?糖业技术论文集（Proc.Sugar.Ind.Technol.)， 52,117-130)。由糖加工流中的右旋糖酐所引起的增加的粘度负面干扰热传递速率，增加 了在蒸发器/加热器上的积垢，减少了糖蜜耗尽并且降低了离心机中的排净效率（杰罗 尼莫（Geronimos)，G.L和P.F?格林菲尔德（Greenfield)(1978)，由于右旋糖酐浓缩糖溶 液和糖蜜中的浓度增加（Viscosityincreasesinconcentratedsugarsolutionsand molassesduetodextrans)，于昆士兰甘鹿技术专家学会论文集（proceedingsofthe QueeslandSocietyofSugarCaneTechnologist)，第 45 次会议，昆士兰，澳大利亚， 119-126 ;辛格尔顿（Singleton)，V.，霍恩（Horn)，J.，比克（Bucke)，C?和艾德勒（Adlard)， M. (2001):用于分析右旋糖酐和鹿糖的一种新的旋光测定法（Anewpolarimetricmethod fortheanalysisofdextranandsucrose)，国际糖业杂志(InternationalSugar Journal)，103 (1230)，251-254 ;金姆（Kim)，D和戴（Day)D.F，（2004)，原糖加工流中的右旋 糖酐的测定（Determinationofdextraninrawsugarprocessstreams)，食品科学与生 物技术（FoodScienceandBiotechnology)，13:248-252)。右旋糖酐的存在还影响结晶速 率，并且引起糖晶体的伸长（科瓦塞维切（Covacevich)MT,理查兹（Richards)GN和G斯托 克（Stokie) (1977)，右旋糖酐结构对鹿糖晶体伸长的影响及分析方法的研究（Studieson theeffectofdextranstructureoncanesugarcrystalelongationandmethodsof analysis)，于XVIISSCT代表大会论文集（ProceedingsoftheXVIISSCTCongress)，圣 保罗（SaoPaulo)，圣保罗州（SP)，巴西（Brazil)，2493-2508)，这对于糖的末端链工厂具 有严重的弊端（文（Vane)G.W. (1981)右旋糖酐对硬糖形变的影响（Theeffectofdextran onthedistortionofhardcandy)，糖业技术论文集（Proc.SugarInd.Technol.)，40， 95-102;海恩斯（Haynes)，L周（Zhou)L和霍普金（Hopkins)W(2004)，精制糖中的右旋糖 酉干：对硬糖加工的影响（Dextraninrefinedsugar:impactonhardcandyprocessing), 糖加工研究所论文集（Proc.SugarProcResInst) :138-146))。因此，可以断定去除右旋 糖酐的益处包括粘度降低，该粘度降低导致糖回收的增加并且还导致了糖质量的改善。具 体而言，高分子量右旋糖酐（>10 6g/gmol)对糖膏的粘度以及处理属性具有一定的影响，并 且因此该类型的右旋糖酐需要由右旋糖酐酶来靶向。
[0008] 当右旋糖酐水平很高时，常在最后一个蒸发器之前，或在汁罐中添加右旋糖酐酶。
[0009] 若干商业右旋糖酐酶产品是可获得的，例如，右旋糖酐酶PlusL(诺维信 (Novozymes)A/S)，其为一种来自变动毛壳菌（Chaetomiumerraticum)的右旋糖酐酶。
[0010] 在本领域中对用于降低甘蔗压榨机、甜菜压榨机以及炼糖厂中的糖溶液中的右旋 糖酐含量的改善的右旋糖酐酶存在需要。
[0011] SWISSPR0T:B2MW82 披露了来自褐红篮状菌（Talaromycespinophilus)的右旋糖 酐酶。
[0012] 本发明提供了具有右旋糖酐酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。
[0013] 发明概述
[0014] 本发明涉及具有右旋糖酐酶活性的一种分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该 组由以下各项组成：
[0015] (a) -种多肽，该多肽与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少80%、至少85%、至少 90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%、至少99%、或100%序列一致性；
[0016] (b) -种多肽，该多肽是由一种多核苷酸编码，该多核苷酸在中-高严谨度条件 下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下与（i)SEQIDN0:1的成熟多肽编码序列、或 (ii) (i)的全长补体杂交；
[0017] (c)-种多肽，该多肽是由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQIDNO: 1的成熟 多肽编码序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少 94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性；
[0018] (d)SEQIDNO: 2的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、 缺失、和/或插入；以及
[0019] (e) (a)、（b)、（c)、或（d)的多肽的一个片段，该片段具有右旋糖酐酶活性。
[0020] 在另外一个方面，本发明涉及一种包括本发明的多肽和一种稳定剂的组合物。
[0021] 在仍另外一个的方面，本发明涉及本发明的右旋糖酐酶用于降低糖溶液粘度的用 途。
[0022] 在另一个另外的方面，本发明涉及一种用于降低糖溶液粘度的方法，该方法包括 将该糖溶液与根据本发明的右旋糖酐酶接触。
[0023] 本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载 体；包括这些多核苷酸的重组宿主细胞；包括本发明的多肽的组合物；以及产生这些多肽 的方法。
[0024] 附图简要说明
[0025] 图1示出了本发明的右旋糖酐酶的温度活性曲线（T_=62°C，pH= 5. 5)。
[0026] 图2示出了通过右旋糖酐酶进行的对右旋糖酐的水解，随后进行LC-MS。在6天 后，主产物对应于葡萄糖单糖和四糖。在第一天后，葡萄糖强度达到了检测器上限。针对于 图中的每个时间点，这些列分别代表（以相同的顺序）：葡萄糖、二糖、三糖、四糖。
[0027] 图3示出了使用mViPr移液管在所测量的压力和粘度（校正曲线）之间的比例性。 它示出了以帕斯卡[Pa]计的压力的排出测量作为以速度4和5使用300yLFinntip伸展 尖端（型号：PMP-105-030J)移液200yL的四个粘度标准（水和S6、N10、N35-Fluka粘度 和密度标准）的实际粘度[cp]的函数。
[0028] 图4示出了两种右旋糖酐酶，右旋糖酐酶PlusL和根据本发明的右旋糖酐酶，在 富含右旋糖酐（〇. 5 %w/v)的合成糖浆（50%w/w)上降低粘度的表现。孵育条件是55°C持 续20min。通过Vipr技术测量粘度。
[0029] 图5示出了右旋糖酐酶在降低富含右旋糖酐（0. 25%w/v)的合成汁（15%w/w) 的粘度上的表现。条件：55°C;pH5. 5 (乙酸盐（ACETATE)缓冲液）；15min。蛋白质剂量： 0. 025ppm(w/v)。基于右旋糖酐当量概念的比较。
[0030] 图6右旋糖酐酶在分解富含右旋糖酐（0.25%w/v)的乙酸盐缓冲溶液（pH5. 5) 的右旋糖酐内容物上的表现。条件：55°C;pH5. 5;15min。蛋白质剂量：0.025ppm(W/v)。基 于右旋糖酐当量概念的比较。
[0031] 定义
[0032] 右旋糖酐酶：术语"右旋糖酐酶"意指一种糖苷水解酶家族49活性（EC 3. 2. 1. 11)，其催化对在两个或两个以上的碳水化物之间或碳水化物和非碳水化物部分之 间的糖苷键的水解。家族GH49右旋糖酐酶水解右旋糖酐聚合物中的a-1，6_糖苷键。出 于本发明的目的，根据实例中所描述的程序确定右旋糖酐酶活性。在一个方面，本发明的这 些多肽具有SEQIDNO:2的成熟多肽的至少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至 少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、或至少100 %的右旋糖酐酶活性。可以根据实例 (例如，实例2)中所描述的测定来确定右旋糖酐酶活性。
[0033] 等位基因变体：术语"等位基因变体"意指占用同一染色体位点的一种基因的两个 或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多 态性。基因突变可以是沉默的（在所编码的多肽中没有改变）或可编码具有改变的氨基酸 序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
[0034] 催化结构域：术语"催化结构域"意指一种酶的含有该酶的催化机构的区域。
[0035] cDNA:术语"cDNA"是指可以通过得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子 的反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先 的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤 进行加工，包括剪接。
[0036] 编码序列：术语"编码序列"意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编 码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子（如ATG、 GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子（如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种 基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
[0037] 控制序列：术语"控制序列"是指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的 核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的（即，来自相同基 因）或外源的（即，来自不同基因），或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括 但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至 少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编 码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提 供有多个接头。
[0038] 表达：术语"表达"包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修 饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
[0039] 表达载体：术语"表达载体"意指一种直链或环状DNA分子，该分子包括编码一种 多肽的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
[0040] 片段：术语"片段"意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失的 一个或多个（例如，若干个）氨基酸的多肽或催化结构域；其中该片段具有右旋糖酐酶活 性。在一个方面，一个片段包含至少570个氨基酸残基（例如，SEQIDNO: 2的氨基酸25至 594)。
[0041] 高严谨度条件：术语"高严谨度条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针 而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并变性的 鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0. 2XSSC、 0. 2 %SDS，在65 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0042] 宿主细胞：术语"宿主细胞"意指易于用包括本发明的一种多核苷酸的一种核酸构 建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语"宿主细胞"涵盖由于复制 期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
[0043] 分离的：术语"分离的"意指处于非天然存在的形式或环境中的物质。分离的物质 的非限制性实例包括（1)任何非天然存在的物质；（2)至少部分地从与其在自然界中相关 联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、 核酸、蛋白质、肽或辅因子；（3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何 物质；或者（4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质 (例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强 的启动子的使用）。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。
[0044] 低严谨度条件：术语"低严谨度条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针 而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的 鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0. 2XSSC、 0. 2%SDS，在50°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0045] 成熟多肽：术语"成熟多肽"意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末 端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，该成熟多肽 是SEQIDNO: 2的氨基酸17至594,并且SEQIDNO: 2的氨基酸1至16是信号肽。本领 域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽 (即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸）的混合物。
[0046] 成熟多肽编码序列：术语"成熟多肽编码序列"意指编码具有右旋糖酐酶活性的成 熟多肽的多核苷酸。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQIDNO: 1的核苷酸49至1782， 并且SEQIDNO: 1的核苷酸1至48编码信号肽。
[0047] 中严谨度条件：术语"中严谨度条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针 而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并变性的 鲑鱼精子DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0. 2XSSC、 0. 2 %SDS，在55°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0048] 中高严谨度条件：术语"中-高严谨度条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的 探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并变 性的鲑鱼精子DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0. 2X SSC、0. 2%SDS，在60°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0049] 核酸构建体：术语"核酸构建体"意指单链-或双链核酸分子，其分离自天然存在 的基