用于虾夷扇贝est-ssr检测的引物及其分子标记方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于虾夷扇贝EST-SSR检测的引物及其分子标记方法。
【背景技术】
[0002] it!下夷扇贝（Patinopecten(Mizuhopecten)yessoensis)属软体动物 门（Mollusea)，辦鲍纲（Lamellibranchia)，翼型亚纲（Pterimorphia)，珍珠贝目 (Pterioida)，扇贝科（Pectinidae)，4下夷扇贝属（Mizuhopecten)。其形态学特征为：4下夷 扇贝的贝壳较大，最大壳高超过20cm，右壳较突出，黄白色，生活时位于下面。左壳稍平，比 右壳稍小，呈淡紫褐色，为上壳。壳近圆形。顶壳顶位于中部，壳顶两侧前后具有同样大小 的耳状突起。左壳有放射肋15~20条，右壳粗壮放射肋15~20条，每条上又有细放射肋 2~4条。贝壳上每年形成一道明显的年轮。右壳的前耳有足丝孔，壳表有15~20条放射 肋。右壳肋宽而低矮，肋间狭。左壳肋较细，肋间较宽。壳内面白色，壳顶下方有三角形的 内韧带。闭壳肌大，1个，位于中央稍后部。外套膜边缘肥厚，其上有20~30个外套眼和 许多的外套触手。软体部外观主要由闭壳肌、外套膜、鳃和内脏囊构成。鳃位于体两侧，各 1对，鳃瓣的上行板末端游离。消化腺褐色，位于壳顶的下方闭壳肌的上方。生殖腺1个。
[0003] 虾夷扇贝分布于朝鲜、俄罗斯远东沿海、千岛群岛南部水域、日本北海道及本州北 部，1982年引入我国。在我国主要分布在黄海北部及山东、辽宁等海域，北方的大连和山东 等海域形成了一定的养殖规模。虾夷扇贝的个体较大，产量高，肉味鲜美，其闭壳肌含有丰 富的营养物质，目前已成为我国主要四大养殖贝类之一。
[0004] 生长和抗病是贝类生物学研究的两大主题，获得生长快、抗病性高的贝类品种，一 直是贝类育种工作者的目标。传统的方法采用多代选育的方法，非常耗费时间和精力，往往 获得一个优良性状的贝类品种需要几代科研工作者的辛勤努力。
[0005] 近年来，在养殖生产中出现的问题说明，虾夷扇贝的种质保护和复壮工作刻不容 缓，人工育苗的生产方式有待改进，苗种质量有待提高。
【发明内容】
[0006] 本发明的用于虾夷扇贝EST-SSR检测的引物，在检测过程中同时使用该引物，所 述的引物共有11组：
[0007] 第1组引物：其序列如序列表SEQIDNO:1~2所示；
[0008] 第2组引物：其序列如序列表SEQIDNO:3~4所示；
[0009] 第3组引物：其序列如序列表SEQIDNO:5~6所示；
[0010] 第4组引物：其序列如序列表SEQIDNO:7~8所示；
[0011] 第5组引物：其序列如序列表SEQIDNO:9~10所示；
[0012] 第6组引物：其序列如序列表SEQIDNO: 11~12所示；
[0013] 第7组引物：其序列如序列表SEQIDNO: 13~14所示；
[0014] 第8组引物：其序列如序列表SEQIDNO:15~16所示；
[0015] 第9组引物：其序列如序列表SEQIDNO:17~18所示；
[0016] 第10组引物：其序列如序列表SEQ ID NO : 19~20所示；
[0017] 第11组引物：其序列如序列表SEQIDNO:21~22所示。
[0018] 本发明的一种利用虾夷扇贝EST-SSR的虾夷扇贝分子标记方法，它是按照以下步 骤进行的：
[0019] -、提取虾夷扇贝的DNA;
[0020] 二、采用权利要求1的引物组对虾夷扇贝样本进行PCR扩增；
[0021] 三、对PCR产物进行电泳分析，依据电泳结果对虾夷扇贝进行遗传多样性及其与 生长性状分析。
[0022] 本发明包含以下有益效果：
[0023] 本发明从扇贝11960个EST序列中查找获得121个微卫星序列，占整个ESTs数据 库的1. 01%，与从其它物种的ESTs数据库中筛选出来的微卫星序列的比例大体相符。
[0024] 本发明经过筛选的EST-SSRs可以用于群体遗传分析、生长性状分析、与功能基因 连锁标记的筛选等研究，是虾夷扇贝现有微卫星标记量的有效补充，而在一些缺少微卫星 标记的种类，EST-SSRs的开发和利用势必推动此种类遗传背景的研究。
[0025] 本发明检测了11个产生预期扩增片段的微卫星标记在虾夷扇贝养殖群体的多态 性。在虾夷扇贝进一步的遗传分析中如果选取更多的样品或不同的种群，可能检测到更高 水平的多态。
[0026] 本发明在最初的筛选过程中已经过滤了多态潜能很低的，搜索出的虾夷扇贝长度 大于或等于20bp的EST-SSRs进行引物设计。在实验中11对呈现多态性标记中低级基元 的有9对，占所有多态性引物的81. 82%。同Dreisigacker等报道的类似，这些高级基元标 记的多态性水平的欠缺可能与它们在复制过程中不易发生滑动有一定关系。
[0027] 本发明从23个有扩增产物的标记中发现11个具有多态性的标记，多态性 比例也较高，达到47. 83 %，其中高度多态标记2个（PICX). 5)，中度多态标记8个 (0. 25〈PIC〈0. 5)，平均PIC值为0. 3753,可用于群体的遗传多样性研究，是虾夷扇贝 现有微卫星标记量的有效补充，而在一些缺少微卫星标记的种类，EST-SSRs的开发和 利用势必推动此种类遗传背景的研究。对于EST-SSRs多态性相对较低的缺点，可以 通过筛选EST-SSRs，优化PCR反应程序等方面进行探索，例如选用具有较高重复数的 EST-SSRs(n彡10的双碱基重复序列和n彡5的三碱基或四碱基重复序列）。
【附图说明】
[0028] 图1为虾夷扇贝的基因组DNA的1%琼脂糖凝胶电泳图谱；
[0029] 图2为11个EST-SSRsPCR产物的2%琼脂糖凝胶电泳图；其中，1:引物P-IPCR 产物，2:引物P-2PCR产物，3:引物P-3PCR产物，4:引物P-4PCR产物，5:引物P-5PCR 产物，6:引物P-6PCR产物，7:引物P-7PCR产物，8:引物P-8PCR产物，9:引物P-9PCR 产物，10:引物P-10PCR产物，11:引物P-IlPCR产物，M:DL2000Marker;
[0030] 图3为虾夷扇贝EST-SSRsP-I聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0031] 图4为虾夷扇贝EST-SSRsP-2聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0032] 图5为虾夷扇贝EST-SSRsP-3聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0033] 图6为虾夷扇贝EST-SSRsP-4聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0034] 图7为虾夷扇贝EST-SSRsP-5聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0035] 图8为虾夷扇贝EST-SSRsP-6聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0036] 图9为虾夷扇贝EST-SSRsP-7聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0037] 图10为虾夷扇贝EST-SSRsP-8聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0038] 图11为虾夷扇贝EST-SSRsP-9聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0039] 图12为虾夷扇贝EST-SSRsP-IO聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0040] 图13为虾夷扇贝EST-SSRsP-Il聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0041] 一：本实施方式的用于虾夷扇贝EST-SSR检测的引物，在检测过程 中同时使用该引物，所述的引物共有11组：
[0042] 第1组引物：其序列如序列表SEQIDNO:1~2所示；
[0043] 第2组引物：其序列如序列表SEQIDNO:3~4所示；
[0044] 第3组引物：其序列如序列表SEQIDNO:5~6所示；
[0045] 第4组引物：其序列如序列表SEQIDNO:7~8所示；
[0046] 第5组引物：其序列如序列表SEQIDNO:9~10所示；