一种分选人细胞的免疫磁珠、其制备及切除方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学生物学实验技术领域，涉及一种分选人细胞的免疫磁珠、其制备 及切除方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一，手术、放疗、化疗等传统治疗方法已经难以 杀灭体内残存的肿瘤细胞。21世纪，随着肿瘤治疗的科技进步，已发展进入生物治疗的技术 系统。其中，生物治疗是目前最为成熟、应用最为广泛的肿瘤生物治疗方法。生物治疗就是 从患者的外周血中采集单个核细胞（PBMC)，然后送到GMP工作室内进行培养、扩增、诱导、 行肿瘤抗原刺激，从而获得能识别癌细胞的DC细胞和具有高杀瘤活性的CIK细胞，然后如 同打点滴一样分次回输到患者体内，有效抑制肿瘤细胞生长、消除转移病灶，达到预防和控 制肿瘤复发和转移的目的，实现延长患者生存期、提高患者生活质量的多重目标。
[0003]目前患者PBMC细胞提取多采用机器采集细胞之后进行Ficoll密度梯度离心法分 离，从而得到高密度的PBMC细胞。但是由于该方法耗时较长，不利于后续细胞培养，并且收 集到的PBMC细胞纯度80%，回收率80%左右，一定程度上造成了细胞的浪费。
【发明内容】
[0004] 针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种新的通过制备带有抗体的免疫磁珠 来进行分选人细胞的方法，分选过后可以通过酶切的方式将磁珠去除，从而提高目的细胞 的纯度，也不影响后续细胞的培养，可以在临床及实验室方面大量推广。
[0005] 为了实现上述目的，本发明提供了一种磁珠-核酸-抗体复合物，通过抗体特异性 地识别细胞来达到分选的目的，再通过磁分离的方式将磁珠连同细胞一并分离处理，最后 再通过高保真酶将磁珠-核酸-抗体复合物中的核酸切断，从而达到磁珠与细胞的分离。
[0006] 本发明的磁珠_核酸-抗体复合物包含磁珠、共价偶联于磁珠上的核酸、以及与核 酸共价偶联的抗体，其中，所述核酸包含至少一个酶切位点，且所述抗体能与待筛选细胞表 面上的抗原特异性结合。
[0007] 在一个【具体实施方式】中，所述磁珠表面带有反应性基团，例如氨基或羧基。
[0008] 在一个【具体实施方式】中，所述磁珠的材料为Fe3O4或Fe 203，粒径为IOnm到10 y m。
[0009] 在一个具体实施例中，所述磁珠的材料为Fe3O4或Fe 203，粒径为IOOnm到2 y m。
[0010] 在一个【具体实施方式】中，所述核酸经由偶联剂与磁珠共价偶联。
[0011] 在一个【具体实施方式】中，所述抗体通过偶联剂与核酸共价偶联。
[0012] 在一个【具体实施方式】中，所述偶联剂为戊二醛。
[0013] 在一个【具体实施方式】中，所述核酸为单链或双链DNA，所述酶切位点可被限制性内 切酶或核酸酶酶切断裂。
[0014] 在一个【具体实施方式】中，所述抗体识别选自以下的细胞的表面抗原：外周血细胞、 造血细胞、神经干细胞和肿瘤细胞。
[0015] 在一个【具体实施方式】中，所述磁珠通过戊二醛将其表面的氨基与核酸5'端的氨基 共价结合形成磁珠-核酸复合物。
[0016] 在一个【具体实施方式】中，所述核酸3'端的氨基通过戊二醛与抗体上的氨基共价结 合。
[0017] 在一个【具体实施方式】中，所述细胞为人细胞，选自红细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒 细胞、嗜碱性粒细胞、外周血单核细胞或淋巴细胞。
[0018] 在一个【具体实施方式】中，所述酶切位点选自NotI和Sail的酶切位点。
[0019] 在一个【具体实施方式】中，所述核酸包含gcggccgc和/或gtcgac。
[0020] 在一个【具体实施方式】中，所述核酸如SEQIDNO:1所示。
[0021] 在一个【具体实施方式】中，所述核酸长50~150个碱基。
[0022] 在一个【具体实施方式】中，所述抗体特异性识别细胞表面的⑶3、⑶14或⑶45抗原。
[0023] 在一个【具体实施方式】中，所述细胞为外周血单个核细胞（PBMC)。
[0024] 在一个【具体实施方式】中，细胞为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核 细胞或淋巴细胞。
[0025] 在一个【具体实施方式】中，所述核酸3'端和5'端的一个或数个碱基选自胞嘧啶、腺 嘌呤和鸟嘌呤。
[0026] 在一个【具体实施方式】中，所述磁珠-核酸-抗体复合物具有以下特征：
[0027] ⑴所述磁珠的材料为Fe3O4或Fe 203,粒径为IOOnm到2 y m ;
[0028](2)所述磁珠表面含有氨基官能团；
[0029] (3)所述磁珠通过戊二醛将其表面的氨基与核酸5'端的氨基共价结合形成磁 珠-核酸复合物；
[0030] (4)所述核酸3'端的氨基通过戊二醛与抗体上的氨基共价结合；
[0031] (5)所述核酸含有gcggccgc和/或gtcgac，或者其序列如SEQIDNO: 1所示；和
[0032](6)所述抗体为特异性识别外周血单个核细胞中的淋巴细胞表面抗原的抗体。
[0033] 本发明提供一种制备磁珠-核酸-抗体复合物的方法，所述方法包括：
[0034](1)将表面带有反应性基团的磁珠与偶联剂孵育；
[0035](2)将核酸与偶联剂孵育；
[0036] (3)将步骤（1)所得的偶联了偶联剂的磁珠和步骤（2)所得的偶联了偶联剂的核 酸混合，孵育，获得共价偶联了核酸的磁珠；
[0037] (4)将抗体与步骤（3)所得的共价偶联了核酸的磁珠孵育，从而制备得到所述磁 珠-核酸-抗体复合物。
[0038] 在一个【具体实施方式】中，步骤（1)、（2)和（3)的孵育在室温下进行，时间为1~3 小时。
[0039] 在一个【具体实施方式】中，步骤（4)的孵育在室温下进行，时间为10~20小时。
[0040] 在一个【具体实施方式】中，用PBS缓冲液重悬步骤（3)获得的共价偶联了核酸的磁 珠，磁分离。
[0041] 在一个【具体实施方式】中，步骤（4)中，将抗体与步骤（3)所得的共价偶联了核酸的 磁珠孵育后，磁分离，然后用PBS缓冲液重悬磁珠团块，磁分离。
[0042] 本发明还提供一种分选细胞的方法，所述方法包括：
[0043] (1)将本发明的磁珠-核酸-抗体复合物与含有目标细胞的细胞混合物接触，孵 育；
[0044] (2)对孵育完成的细胞进行磁分离，获得结合了细胞的磁珠；
[0045] (3)对所述结合了细胞的磁珠进行酶切；
[0046] (4)对步骤（3)酶切后的混合物进行磁分离，获取上清液；和
[0047] (5)从上清液中分离出目标细胞。
[0048] 在一个【具体实施方式】中，所述分选细胞的方法包括：
[0049] (a)将本发明的磁珠-核酸-抗体复合物与含有目标细胞的细胞混合物接触，孵 育；
[0050] (b)对孵育完成的细胞进行磁分离，获得结合了细胞的磁珠；
[0051] (C)用酶切缓冲液重悬细胞；
[0052] (d)加入酶，进行酶切；
[0053] (e)对步骤（d)酶切后的混合物进行磁分离，获取上清液；和
[0054] (f)从上清液中分离出目标细胞。
[0055] 本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明所述的磁珠-核酸-抗体复合 物。
[0056] 在一个【具体实施方式】中，试剂盒中还含有能切割所述核酸的酶以及相应的酶切缓 冲液。
[0057] 本发明还提供本发明所述的磁珠-核酸-抗体复合物在细胞分选以及制备用于分 选细胞的试剂盒中的用途。
[0058] 本发明的磁珠_核酸-抗体复合物与同类产品相比，其优势在于：
[0059] ①所选用的限制性内切酶为高保真酶，可以在温和环境中快速酶切，5-10分钟即 可完成酶切；
[0060] ②酶切反应不影响细胞活性，有利于后续细胞培养；
[0061] ③在酶切反应过程中，磁珠的切除效率很高；和
[0062] ④在后续培养细胞过程中，用于分选的磁珠不会进入人体，在临床上安全可靠。
【附图说明】
[0063] 图1显示实施例2中外周血单个核细胞的流式细胞仪检测⑶3_PECy7阳性的比例 (34. 1% ) 〇
[0064] 图2显示实施例2中分选完成之后阴性细胞中流式细胞仪检测⑶3_PECy7阳性的 比例（2. 5% )。
[0065] 图3显示实施例2中分选完成后带有磁珠的细胞流式细胞仪检测⑶3_PECy7阳性 的结果（80. 7% )，比例只有80%的原因在于流式细胞仪受磁珠的影响，一部分的磁珠会被 系统记为阴性从而降低了细胞的纯度。
[0066] 图4显示实施例2中分选完成后带有磁珠的细胞在显微镜下的照片。
[0067] 图5显示实施例3中切除完磁珠后细胞进行流式细胞仪检测⑶3_PECy7阳性的结 果（95. 8% ) 〇
[0068] 图6显示实施例3中切除完磁珠后细胞在显微镜下的照片。
[0069] 图7显示细胞初始状态，⑶14阳性细胞比例占39. 2%。
[0070] 图8显示分选过后细胞中⑶14阳性细胞所含比例仅为0. 3%。
[0071 ] 图9显示最终经过切除磁珠后收集到的⑶14阳性细胞所占比例91. 3%。
[0072] 图10显示细胞初始状态，CD45阳性细胞比例占49. 5%。
[0073] 图11显示分选过后细胞中⑶45阳性细胞所含比例仅为3. 4%。
[0074] 图12显示最终经过切除磁珠后收集到的⑶