一种用于快速检测唐氏综合征无重复片段的fish探针、试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于快速检测唐氏综合征无重复片段的 FISH探针、试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 焚光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH)是在 20 世纪 80 年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以 荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法.FISH的基本原理是将DNA(或 RNA)探针用特殊的核苷酸分子或者荧光素分子偶联标记，然后将探针直接杂交到染色 体或DNA纤维切片上，通过与靶序列的特异性结合来进行DNA的定性、定位、相对定量分 析.FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点。
[0003] 21-三体（唐氏综合征）又称先天愚型或Down综合征，是由胎儿21号染色体三体 引起的出生缺陷，是小儿最为常见的由常染色体畸变性所导致的出生缺陷类疾病，也是智 力低下最常见的遗传性病因。21号染色体异常检测在产前诊断中具重要意义，而FISH方法 比传统的核型分型技术更具优势，不需中期细胞培养、更加灵敏、出报告时间由两周缩短至 两天。
[0004] 常规FISH杂交时间在10~24小时，需过夜进行检测。基于BAC的杂交探针包含 大量重复片段，序列的复杂性导致杂交时间长，杂交背景高，易受外界条件影响。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于快速检测唐氏综合征 无重复片段的FISH探针。
[0006] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] -种用于快速检测唐氏综合征无重复片段的FISH探针，该FISH探针以人类全基 因组为模板，利用105对特异性的引物对进行PCR扩增反应而得，所述105对引物对的序列 为SEQIDNO.I-SEQIDNO. 210。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种用于快速检测唐氏综合征无重复片段的FISH探 针的制备方法，该制备方法的步骤如下：
[0009] 1)片段筛选：通过NCBI数据库检索21q22区片段，使用fliter屏蔽重复区段，得 到非重复序列；
[0010] 2)引物设计：将上述非重复序列导入引物设计软件对片段长度大于500bp的序列 进行引物设计，设计引物扩增产物在574-2617bp之间，并人工合成105对特异性引物，序列 为SEQIDNO.I-SEQIDNO. 210 ;
[0011] 3)PCR扩增：以人类基因组DNA为模板，结合上述105对特异性引物，分别在PCR体 系中进行体外扩增，通过2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，确认PCR的特异性 的扩增产物；
[0012] 4)克隆质粒的制备：将上述扩增产物纯化后得到目的产物，再将目的产物与载体 PMD18-T连接，制备出包含目的片段的克隆质粒；
[0013] 5)制备探针：以上述包含目的片段的克隆质粒为模板，制备荧光素标记的FISH探 针。
[0014] 具体地，步骤3)所述PCR体系为：
[0015]
[0017] PCR反应条件为：
[0018] 95cC3 分钟；
[0019] 94°C30 秒，58°C30 秒，72°C45 秒，40 个循环；
[0020] 72cC10 分钟。
[0021] 具体地，步骤5)探针的制备方法如下：以包含目的片段的质粒混合物为模板，使 用荧光素标记的dUTP直接进行PCR扩增，将PCR产物标记荧光，避光、-20 °C储存。
[0022] 进一步地，步骤5)所述的PCR扩增中PCR反应体系：
[0023]
[0024] 具体地，步骤5)探针的制备方法如下：以包含目的片段的质粒混合物为模板，使 用荧光素标记的dUTP利用切口平移方法进行反应，将质粒标记荧光，避光、_20°C储存。
[0025] 本发明的另一个目的在于所述的FISH探针在制备快速检测唐氏综合征的试剂或 试剂盒中的应用。
[0026] 本发明的又一目的在于提供一种试剂盒，该试剂盒包含本发明所述的FISH探针 的。
[0027] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0028] 1.相对于传统的BACFISH，本发明所述的FISH探针不包含重复序列，反应体系中 不需使用封闭DNA，背景更低；探针中所包含的短片段在进行杂交时较长片段（如基于BAC 细菌人工染色体）所需的时间更短；
[0029] 2.本发明所述的FISH探针可以很好检测出21号染色体异常，具有反应快速特点， 能够应用于唐氏综合征快速检测；
[0030] 3.本发明所述的试剂盒具有反应灵敏、快速等特点。
[0031] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0032] 图1为105对特异性引物对对应的PCR产物的电泳图，其中1-105对应每对引物 的编号；
[0033] 图2中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交后的荧光信号图；
[0034] 图3 21三体样本检测图；
[0035] 图4 21正常样本检测图。
【具体实施方式】
[0036] 一种用于快速检测唐氏综合征无重复片段的FISH探针，该FISH探针以人类全基 因组为模板，利用105对特异性的引物对进行PCR扩增反应而得，所述105对引物对的序列 为：SEQIDNO.I-SEQIDNO. 210。
[0037] 本发明的另一目的在于提供一种用于快速检测唐氏综合征无重复片段的FISH探 针的制备方法，该制备方法的步骤如下：
[0038] 1)片段筛选：通过NCBI数据库检索21q22区片段，使用fliter屏蔽重复区段，得 到非重复序列；
[0039] 2)引物设计：将上述非重复序列导入引物设计软件对片段长度大于500bp的序列 进行引物设计，设计引物扩增产物在574-2617bp之间，并人工合成105对特异性引物，序列 为SEQIDNO.I-SEQIDNO. 210 ;
[0040] 3)PCR扩增：以人类基因组DNA为模板，结合上述105对特异性引物，分别在PCR体 系中进行体外扩增，通过2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，确认PCR的特异性 的扩增产物；
[0041] 4)克隆质粒的制备：将上述扩增产物纯化后得到目的产物，再将目的产物与载体 PMD18-T连接，制备出包含目的片段的克隆质粒；
[0042] 5)制备探针：以上述包含目的片段的克隆质粒为模板，制备荧光素标记的FISH探 针。
[0043] 具体地，步骤3)所述PCR体系为：
[0046] PCR反应条件为：
[0047] 95°C3 分钟；
[0048] 94°C30 秒，58°C30 秒，72°C45 秒，40 个循环；
[0049] 72 cC 10分钟。
[0050] 具体地，步骤5)探针的制备方法如下：以包含目的片段的质粒混合物为模板，使 用荧光素标记的dUTP直接进行PCR扩增，将PCR产物标记荧光，避光、-20 °C储存。
[0051] 进一步地，步骤5)所述的PCR扩增中PCR反应体系。
[0052]
[0053] 具体地，步骤5)探针的制备方法如下：以包含目的片段的质粒混合物为模板，使 用荧光素标记的dUTP利用切口平移方法进行反应，将质粒标记荧光，避光、_20°C储存。
[0054] 本发明的另一个目的在于所述的FISH探针在制备快速检测唐氏综合征的试剂或 试剂盒中的应用。
[0055] 以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中除了FISH探针以外，其余的试剂均 可以通过市售途径获取。
[0056] 实施例1
[0057] 1)片段筛选：
[0058] 21三体常检测区域为21q22. 3区，分析该区，去除重复片段，以N表示，参数如下： cytoBand22q22. 13[range=chr21:37800001-39700000]repeatMasking=N;分析结果表 明，选取的402kb序列中，非重复序列长度约211kb，重复序列长度约191kb(占近1/2)，部 分序列见SEQIDNO. 211，
[0059] 2)引物设计：选择长度大于500bp的148个非重复区段设计特异引物对，采用 ABI9700PCR仪进行PCR扩增，产物长度在469bp~5080bp间；结果筛选出105条产物序列 满足检测需求，105对特异性引物及产物序列如下：
[0060]
[0067] 总体积为50yL，设置循环参数为：95°C3分钟；（94°C30秒，58°C30秒，72°C45 秒）X40循4 ;72°C10分钟；反应结束后，取5yL产物2%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见 图1，图1结果显示均见明亮的条带；
[0068] 3)克隆质粒的制备：
[0069] 以人基因组为模板进行PCR扩增，将纯化后的目的产物与载体pMDlS-T连接，使用 Promegap:GEM?-TEasyVectorSystemI，按照说明书操作方法对上述PCR产物进行克 隆，筛选得到的阳性克隆菌进行鉴定，然后使用TaKaRaMiniBESTPlasmidPurification KitVer. 2. 0按照说明书要求的操作方法进行质粒DNA提取，制备出包含目的片段的克隆 质粒。通过微量分光光度计对质粒DNA定量；采用纯化水稀释为IOOng/y1，-20°C密封保 存；
[0070] 4)制备探针：
[0071] 取定量后的稀释质粒（lOOng/y1)各5ul混合，得到质粒混合物（PM)，单个质粒 浓度约IngAil，以该质粒为模板，通过切口平移方法对质粒DNA进行焚光标记；使用abbott molecularNickTranslationKit，按说明书要求进行REDdUTP标记；严格避光条件下，在 冰上配制PCR反应体系：
[0072]
[0073] 配完后混匀，16°C标记12小时，再80°C孵育10分钟灭活酶；取5y1使用2%琼脂 糖凝胶电泳，观察产物成均匀弥散状，主条带集中在500bp左