No. 04913914001)。该产品要求单个定量反应中 基因组初始含量不高于250ng，单条定量引物的最终体系浓度在100-400nM。反应在384孔 PCR板中进行。
[0074] 反应体系的配制，见表1。
[0075] 表1荧光定量PCR反应体系
[0077] 2、定量反应的上机操作
[0078] 本实施例中使用的定量分析仪器为AppliedBiosystems公司的7900HTFast Real-TimePCRSystem。选择384孔定量板和RQ检测模式，输入内参基因信息和待检测基 因信息。按表2中的程序运行荧光定量PCR反应。
[0079] 表2荧光定量PCR反应程序
[0081] 3、定量结果的数据分析
[0082] 荧光定量PCR反应完成后，仪器将生成相关数据，下载内参基因和目标基因的平 均Ct值，根据公式，计算对应样本的RQ检测值。若RQ值为1，则表示目标基因与内参基因 相对拷贝数一致，大于1，则表示目标基因相对拷贝数大于内参基因，反之，若RQ值小于1， 则表示目标基因相对拷贝数小于内参基因。此时，根据所选取的内参基因相对拷贝数情况 就可得出检测样品的相对拷贝数情况。
[0083] 本实施例中定量PCR采用384孔板模块，10ill扩增体系，每个基因做双重重复，根 据需要选择扩增循环数，一般在28-32个循环内完成扩增，既准确又高效。
[0084] 水稻Epsps_CP4基因的拷贝数检测结果如表3所示。
[0085] 表3水稻Epsps-CP4基因的拷贝数检测结果
[0087] 四、水稻Southern杂交检测
[0088] 在高通量的检测和计算中，实际计算的RQ值往往与其理论值之间存在偏差。为更 准确的确定检测样品的拷贝数，需要对实际测得的RQ值进行区间的划分。
[0089] 本发明中选取不同大小RQ的若干样品，进行Southern杂交。Southern杂交探针 标记及杂交与显影米用Roche公司DIGHighPrimerDNALabelingandDetectionStarter KitI。本实施例中对于内参为单拷贝的二倍体材料，RQ在0. 1-0. 6区间的靶标基因为单拷 贝。具体实验方法如下：
[0090]I、CTAB法抽提转化植株总基因组DNA
[0091] (1)分单株取叶片0. 5-lg，放入预冷的研钵中，加入液氮快速将叶片研磨成粉末， 倒入2mL离心管中。加入700ill预热至65°C的I. 5%CTAB提取液并摇匀，65°C水浴保温 30-60min，期间摇动几次；
[0092] (2)室温冷却后，加入700ii1氯仿，摇匀后，颠倒轻摇IOmin,室温下8000rpm离心 IOmin；
[0093] (3)将上清移至另一离心管中，加入等体积的沉淀液（异丙醇），-20°C下沉淀30 分钟，室温下8000rpm离心IOmin;
[0094] (4)用700iil75%乙醇漂洗2-3次，风干后溶于50iUTE中，_20°C保存备用。
[0095] 2、基因组DNA的酶切
[0096] 选用合适的限制性内切酶酶切转化植株总基因组DNA，酶切反应体系如下：
[0097]
[0098] 混匀后于37°C酶切10_18h左右，酶切后先取5ill酶切产物进行预电泳，检测酶切 效果。最后将酶切后的总DNA在1%的琼脂糖凝胶中进行低电压（30-40V)电泳过夜。
[0099] 3、转膜
[0100] 将凝胶修整后切去右下角作为标记，浸泡在〇. 25mol/LHCl至溴酚蓝变黄，蒸馏 水洗两次；碱变性液（1.5MNaCl，0. 5MNa0H)中变性45min，去离子水漂洗；中和液（1M Tris-HCl(pH7. 4)，I. 5MNaCl)中漂洗30min，更换中和液漂洗15min;置于搭好的转膜台上， 用10XSSC作为转膜液，Hybond-N+尼龙膜漂洗于去离子水液面，直至完全湿润，浸入转移 缓冲液中；用10XSSC溶液进行毛细管法转移16-20h，将胶上的DNA转移到尼龙膜上。转 移结束后，将尼龙膜用2XSSC溶液简单漂洗后，紫外交联仪上交联Imin后，室温晾干，用保 鲜膜将膜包好，4°C下保存备用。
[0101] 4、探针合成及杂交与显影
[0102] 探针标记及杂交与显影采用Roche公司DIGHighPrimerDNALabelingand DetectionStarterKitI，按照试剂盒的说明进行操作。
[0103] 5、杂交
[0104] (1)加热杂交液016 6&87办6(101111/100〇112)，在杂交炉中421：下预杂交30分钟 ；
[0105] (2) 95°C下变性探针（25ng/ml)，5分钟后置于冰上；
[0106] (3)将变性探针加入到预先加热的DIGEasyHyb中（3. 5ml/100cm2)，混匀；
[0107] (4)倒掉预杂交液，加入变性的探针；
[0108] (5)杂交炉中42°C下杂交4h-0/N。
[0109] 6、洗膜
[0110] 倒掉杂交液，然后用2XSSC，0. 1%SDS室温下洗涤两次，每次5分钟；最后用 0? 5XSSC，0. 1%SDS，65°C下洗涤两次，每次15分钟。
[0111] 7、显色
[0112] 同探针检测操作。结果如图3所示。
[0113] 水稻Southern杂交与Real-timePCR鉴定对照结果如表4所示。
[0114] 表4水稻Epsps_CP4基因的拷贝数检测结果对照
[0116]RQ值为0.5±0. 1时，转基因水稻目标基因拷贝数均为1，即单拷贝，证明了本发明 Real-timePCR鉴定拷贝数的准确性。
[0117] 选择RQ值0. 1-1.5的转基因水稻用于育种，其拷贝数对应范围在1-3之间，属于 低拷贝植株，适合育种应用。
[0118] 实施例2鉴定转基因玉米中目标基因拷贝数并筛选低拷贝植株
[0119] 本实施例中转基因玉米（含目标基因GFP基因）来源于中国种子集团有限公司。
[0120] 基本步骤包括：高通量抽提水稻基因组DNA、目的基因与标准化基因引物筛选、定 量反应体系的制备、定量反应的上机操作及数据分析，以及转化植株外源基因的Southern 杂交检测。本实施例中，除了定量反应上机操作反应程序的循环数为32外，其他操作方式 与实施例1基本一致。
[0121] 一、玉米目的基因与标准化基因引物筛选
[0122] 玉米内参基因Ivrl和外源基因Epsps-CP4的效率检测如图2所示，Efficiency 达到0. 999,即效率为99. 9%，证明该定量引物达到检测要求，内参和外源基因扩增效率一 致。
[0123] 二、定量结果的数据分析
[0124] 本实施例中荧光定量PCR采用384孔板模块，10ill扩增体系，每个基因做双重重 复，在32个循环内完成扩增，既准确又高效。
[0125] 玉米GFP基因的拷贝数检测结果如表5所示。
[0126] 表5玉米GFP基因的拷贝数检测结果
[0129] 三、玉米Southern杂交检测
[0130] 玉米Southern杂交检测如图4所示。
[0131] 玉米Southern杂交与Real-timePCR鉴定对照结果如表6所示。
[0132] 表6玉米GFP基因的拷贝数检测结果对照
[0134]RQ值为0.5±0. 1时，转基因水稻目标基因拷贝数均为1，即单拷贝，证明了本发明 Real-timePCR鉴定拷贝数的准确性。
[0135] 选择RQ值0. 1-1. 5的转基因水稻用于育种，其拷贝数对应范围在1-3之间，属于 低拷贝植株，适合育种应用。
[0136] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种高通量鉴定转基因植物中目标基因拷贝数并筛选低拷贝植株的方法，其特征在 于，包括以下步骤： 1) 提取待测转基因植物基因组DNA ; 2) 筛选目标基因荧光定量PCR引物与内参基因荧光定量PCR引物，保证目标基因和内 参基因扩增效率一致； 3) 以转基因植物的基因组DNA为模板，分别用目标基因引物和内参基因引物进行荧光 定量PCR ;指定一个荧光信号阈值，根据目标基因和内参基因的循环次数的差值，确定待测 转基因植物中的目标基因的拷贝数； 4) 筛选低拷贝转基因植株； 5) 通过Southern杂交技术，对获得的拷贝数进行校正。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转基因植物是转基因水稻或玉米。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述转基因植物是转基因水稻，所述目标 基因是抗草甘膦基因Epsps-CP4,所述内参基因是水稻Actin7基因。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述目标基因荧光定量PCR引物包括正 向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQ IDNo. 5和6所示，所述内参基因荧光定量PCR 引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No. 9和10所示。5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述转基因植物是转基因玉米，所述目标 基因是绿色荧光蛋白基因GFP，所述内参基因是玉米Ivrl基因。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述目标基因荧光定量PCR引物包括正向 引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No. 3和4所示，所述内参基因荧光定量PCR 引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No. 11和12所示。7. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，对转基因水稻进行荧光定量PCR扩增时， 反应体系为：FastStart Universal SYBR Green Master[R0X]5ii l，300nM 的正、反向引物各 1.25111、 模板0嫩2.5111;反应程序为：951：10111111;951：1086(3,601：3086(3，共28个循环。8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，对转基因玉米进行荧光定量PCR扩增时， 反应体系为：FastStart Universal SYBR Green Master[R0X]5ii l，300nM 的正、反向引物各 1.25111、 模板0嫩2.5111;反应程序为：951：10111111;951：1086(3,601：3086(3，共32个循环。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中荧光信号阈值为0. 2, RQ值为 0. 1-1. 5〇10. 根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中筛选目标基因荧光定 量PCR引物与内参基因荧光定量PCR引物时所用的DNA模板为待测转基因植物基因组DNA。
【专利摘要】本发明提供一种高通量鉴定转基因植物中目标基因拷贝数并筛选低拷贝植株的方法，采用Real-Time实时荧光定量PCR技术，选取合适的物种标准化基因(即内参基因)，与外源基因进行相对定量的检测，通过二者的扩增曲线，计算外源基因拷贝数，再结合传统的Southern杂交技术，对获得的拷贝数进行校正。按照对转基因作物不同拷贝数的需求，通过本方法，可以快速、高通量的检测和筛选到转基因作物中所需的拷贝植株。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105087759
【申请号】CN201410188109
【发明人】王绪霞, 滕晓璐, 黄炜, 陈凯, 李晨, 刘博林, 马崇烈
【申请人】中国种子集团有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月6日