一种诱导三分三毛状根的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物生物技术领域，尤其是三分三叶片愈伤组织的产生及毛状根的诱 导形成。
【背景技术】
[0002] 三分三（Anisooks 知61C.Y.WuetC.Chen)为我国特有的一种前科多年 生珍稀草本药用植物，以根、茎、叶和种子入药，味苦、辛，性温，有剧毒，剂量超过三分三厘 则可能中毒，故名三分三。其根、茎、叶和种子均富含托品烷类生物碱，主要有莨菪碱、山莨 菪碱、东莨菪碱和樟柳碱，具有较强的抗胆碱生理活性，用于各种诱因引起的休克、成人呼 吸窘迫综合症、重症肝炎等多种疾病，其中，莨菪碱、东莨菪碱是重要的反副交感神经作用 类药物，临床上主要用作镇静剂，需求量不断增加。
[0003] 开发和利用天然药物已成为现代医药的重要领域，但由此也对许多野生名贵中药 材资源造成严重威胁。应用现代生物技术生产天然药用有效成分则可以有效缓解药用植物 资源压力，并能为中药的安全、有效、稳定、可控提供保障。毛状根作为生物反应器具有生产 周期短、易规模化、不受外界环境干扰而且生理代谢活力强、有效成分产量高、遗传稳定性 好等特点，已被广泛用于药用植物离体培养以大量生产药效成分。毛状根是由植株、器官或 组织经过发根农杆菌感染，在感染过程中发根农杆菌将其携带的Ri质粒上的T-DNA转移到 植物细胞中，并且在宿主细胞基因组中发生整合，进而形成类似于毛发一样细长的根状组 织，故名毛状根或发根。毛状根属于激素自养型，培养基中不需要外加生长调节物质，可有 效降低生产成本。目前为止，国内外毛状根诱导培养技术已在人参、紫草、黄连、丹参、青蒿、 甘草、长春花、黄芪、颠茄、红花等重要药用植物上取得成功，人参皂甙、紫草宁、黄连素、丹 参酮等已通过毛状根培养得以工业化生产。因此，毛状根培养技术在继植物愈伤组织和细 胞离体培养之后，正在成为利用生物技术生产药用天然产物、实现药用植物资源可持续利 用的又一崭新途径。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是：提供一种一种诱导三分三毛状根的方法，它能实现三分三毛状 根的高效诱导和规模化培养，并且丰富了利用生物技术生产天然药用的种类。
[0005] 本发明解决技术问题采用如下技术方案：诱导三分三毛状根的方法，利用发根农 杆菌侵染三分三种子萌发，获得的无菌苗叶片，诱导三分三叶片愈伤组织产生毛状根，以获 取托品烷类生物碱；具体步骤如下： 步骤1 :活化发根农杆菌A4菌株，制备ODfflw=O. 6~0. 8的转化菌液； 步骤2 :将经过预培养的外植体在转化菌液中浸染2~5min后，接种到共培养基上， 置于温度为23~27°C的恒温培养箱中暗培养3~5d; 步骤3 :将所述步骤2中共培养的外植体接种到抑菌培养基上，置于23~27°C的恒温 培养箱中暗培养，直至外植体上愈伤组织产生毛状根； 步骤4 :剪取毛状根接种于脱菌培养基上暗培养1~3周，选取生长快、分支好的毛状 根每2~4周继代一次，头孢霉素Cef?的浓度逐渐降低直到完全脱菌； 步骤5 :配制含rolB基因序列特异性引物的PCR反应体系，提取所述步骤4中获得的 无菌三分三毛状根DNA进行PCR分子检测，以确定三分三叶片愈伤组织产生的毛状根是感 染发根农杆菌A4后毛状根基因rolB表达的结果。
[0006] 步骤1中所述的转化菌液的制备是：将发根农杆菌菌株A4接种于LB添加卡拉霉 素Kan40~60mg/L的液体培养基中，在27~29°C、170~190rpm转速下进行两次振荡 活化，培养至对数生长期，即0D_=0. 6~0. 8 ;将菌液离心并弃掉上清液，沉淀下来的菌体 用MS液体培养基，添加乙酰丁香酮AS50~150ymol/L，悬浮并调节OD6m=O. 6~0. 8,用 于转化。
[0007] 步骤2中所述的外植体是指用三分三种子萌发获得的无菌苗叶片；所述的外植 体预培养是将叶片剪成1.5cmX1.5cm的小片接种在预培养基上，于23~27°C下培养 12 ~48h，预培养基组成为MS+2, 4-D0? 3 ~0? 8mg/L+6-BA0? 5 ~I. 5mg/L+AS50 ~ 150ymol/L，pH5. 8 ;所述的共培养基是MS+2, 4-D0? 3 ~0? 8mg/L+6-BA0? 5 ~I. 5mg/ L?pH5. 8〇
[0008] 步骤3中所述的抑菌培养基是MS+2,4-D 0?3~0?8mg/L+6-BA0?5~I.5mg/L+ Cef100 ~300mg/L，pH5. 8。
[0009] 步骤4中所述的脱菌培养基是MS+Cef100~300mg/L，pH5. 8 ;脱菌培养时间为 2周，以后每3周继代一次。
[0010] 步骤5中所述的rolB基因序列特异性引物大小为741bp，其正 向引物的序列为5 ' -CTATTCCTTCCACGATTTCAACCA-3 '，反向引物的序列为 5 ' -CTGCAGCAGGCTTCATGACGCCC-3 '；所述的PCR反应体系为 2. 5yLNuclease-Free ffater+7. 5yL2XGreenMasterMix+1. 5yL10ymol/LForwardPrimer+1. 5yL10 ymol/LReversePrimer+2yLDNAtemplate;PCR反应条件为 95°C预变性 5min，35 个 循环（95°C变性45s，52°C退火45s，72°C延伸Imin，共10个循环；95°C变性45s，55°C退 火45s，72°C延伸Imin，共25个循环)，72°C延伸10min，4°C保存PCR扩增产物；PCR扩增 产物检测采用2%琼脂糖凝胶（EB染色）电泳（75V，20min)，DNA相对分子质量标准为DL 1000,用Bio-RAD凝胶成像系统拍照。PCR检测结果证明了发根农杆菌A4菌株的毛状根基因 rolB已转移并整合到三分三毛状根基因组中，说明三分三叶片愈伤组织产生的毛状根是叶 片感染发根农杆菌A4后毛状根基因rolB表达的结果。作为优选方案，步骤1中Kan浓度 为50mg/L，AS浓度为100ymol/L，培养温度为28°C，摇床转速为180rpm，OD6m=O. 7。
[0011] 作为优选方案，步骤2中外植体预培养基为MS+2,4-D0.5mg/L+6-BALOmg/ L+AS100ymol/L，预培养温度为（25±1) °C，预培养时间为24h;外植体在转化菌液 中浸染时间为3min;共培养基为MS+2,4-D0. 5mg/L+6-BA1.0mg/L，共培养温度为 (25±1) °C，共培养时间为4d。
[0012] 作为优选方案，步骤3中的抑菌培养基为MS+2,4-D0.5mg/L+6-BALOmg/L+ Cef200mg/L，抑菌培养温度为（25±1) °C。
[0013] 作为优选方案，步骤4中毛状根脱菌培养基为MS+Cef200mg/L，脱菌培养时间为 2周，以后每3周继代一次。
[0014] 由于采用了以上技术方案，与现有技术相比，本发明本发明以三分三叶片为外植 体，利用发根农杆菌A4菌株侵染而诱导叶片愈伤组织产生毛状根，进而获取托品烷类生物 碱，既丰富了利用生物技术生产天然药用的种类，也保障了三分三这一珍稀药用植物资源 的可持续利用。毛状根生产周期短、易规模化、不受外界环境干扰，而且具有生理代谢活力 强、有效成分产量高、遗传稳定性好等特点。本发明获得的三分三毛状根属于激素自养型， 人工规模化培养中不需要外加生长调节物质，可有效降低生产成本，市场前景广阔。
【附图说明】
[0015] 图1为发根农杆菌A4侵染的叶片与对照（CK)的差异； 图2为三分三毛状根单克隆； 图3为三分三毛状根roIB基因的PCR检测； 图3中M为核酸相对分子质量标准DL1000 ;1是空白对照，2、3是作为阴性对照的三 分三普通根，4、5是不同毛状根单克隆，6是作为阳性对照的发根农杆菌A4 ;rolB表示rolB 基因。
【具体实施方式】
[0016] 本发明的实施例：诱导三分三毛状根的方法 本发明中的材料三分三知61 C. Y.Wuet C. Chen)种子由中国科 学院昆明植物研究所提供，三分三无菌组培系统由贵州大学生命科学院植物生理研究室建 立；发根农杆菌A4由贵州大学生命科学院植物生理研究室保存(该菌种为公知菌种，多数 实验室均可获取)。
[0017] (1)活化发根农杆菌，制备转化菌液：在无菌条件下，用接种环挑取于_20°C低温 冰箱中冻存的发根农杆菌A4菌株，在LB+Ka