植物胚和糊粉层特异启动子OsEmb3及相应获取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程领域。具体而言，本发明涉及一种植物胚和 糊粉层特异表达启动子及相应获取方法，该启动子能够用于在水稻调控体系中驱动目标基 因在胚和糊粉层部位表达。
【背景技术】
[0002] 生物体的生长发育、生理过程都是生物体的众多基因有序的、并在外界环境因子 的作用下特定表达的结果。基因正常而有规律的表达保证了植物的正常生长发育。近年来， 分子生物学的研究表明转录水平上的调控是基因表达调控中的起始步骤，也是基因表达调 控的重要方式之一。基因启动子控制着基因在特定的组织、特定的发育阶段以及一定的环 境条件下表达。因而，分离、鉴定基因启动子，了解启动子的时空专一性表达特征及其作用 机制已成为研究基因表达调控的主要内容。
[0003] 组织特异性启动子也称器官特异性启动子，该类启动子所调控的下游基因往往只 在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。目前，为了便于外源基因在 植物体内有利、高效地发挥作用，人们开始越来越多地研究组织特异性启动子、分析特异启 动子中的顺势作用元件及作用机制，并根据需要选择或人工构建合适的启动子，实现对外 源基因表达的定时、定点、定量三维精确调控。例如，组织特异性启动子在植物育种、植物生 物反应器等研究的应用上已初见成效。获得有组织专一性表达特性的启动子也是寻找相关 功能基因的一种有效途径。另外，植物基因工程研究中也需要具有组织特异性高表达启动 子，使外源目的基因能在特定的组织中高效表达。
[0004] 胚是被子植物有性生殖过程中形成的，在植物发育中具有重要的生物学意义。胚 的发育始于合子，经过原胚和胚的分化发育阶段，最后达到成熟。融合形成的二倍体合子， 既保持了物种遗传的相对稳定性，又为后代中可能出现新的遗传性状、新变异提供了基础， 为研究植物遗传和育种提供重要的理论依据。因而，分离、鉴定水稻种胚特异性启动子，了 解胚特异基因表达的时空专一性特征及其相关表达机制已成为研究水稻种胚的发生和发 育的主要内容。对水稻种胚特异性表达的启动子的功能研究与鉴定，将有利于实现外源基 因在转基因植物特定组织中高效表达。
[0005] 近年来有关水稻种子特异性的研究逐渐增多，但由于目前已知的胚发育过程中特 殊分子标记较少，具有种胚特异表达模式的功能基因的报道也不多，故对水稻种子特异性 启动子的研究仍主要集中在胚乳特异性启动子上，像醇溶蛋白基因启动子、球蛋白基因启 动子等，而对胚特异性启动子的研究有报道较少。Kuwano等研究证实水稻OlelS基因的启 动子驱动相关基因在种子种胚中特异表达（PlantBiotechJ，2009, 7:96-105)。Wu等通过 水稻中不同贮藏蛋白相关基因的表达模式分析，从中鉴定了一个水稻种胚中表达强度较高 的水稻球蛋白启动子Glb(PlantCellPhysiol, 1998, 39:885-889)。若选择胚特异性高强 度表达启动子，有助于定时定向调控外源有用蛋白的合成，既节约能源，保证了植物正常生 理活动不受干扰，同时又能提高外源有用蛋白在种子中的储藏水平。同时，利用胚特异启动 子可提高外源基因在植物胚中的表达和累积水平，也可改良种子品质、将具有生理活性的 蛋白或短肽导入种子中创制保健型功能新品种、利用种子作生物反应器生产有用外源蛋白 或可食性疫苗，增加农产品科技附加值等。因此，胚特异启动子及其应用为揭示整个植物胚 胎发育的过程和机理的研究，利用生物技术改良种子品质、分子医药农场等研究奠定了基 础，具有极大的应用前景。
【发明内容】
[0006] 因此，为了满足植物胚胎发育的过程和机理研究的需要，本发明的目的是提供一 种植物胚和糊粉层特异启动子0sEmb3以及相应的获取方法。
[0007] 具体而言，本发明提供一种植物胚和糊粉层特异启动子0sEmb3,所述植物胚和糊 粉层特异启动子0sEmb3能够驱动外源基因在植物的胚和糊粉层中特异性表达。
[0008] 优选地，所述植物胚和糊粉层特异表达启动子0sEmb3包含SEQIDNo: 1所示的 DNA序列或与SEQIDNo: 1所示序列互补的DNA序列，或者由SEQIDNo: 1所示的DNA序列 或与SEQIDNo: 1所示序列互补的DNA序列构成。序列表中SEQIDNo: 1所示的DNA序列 为来源于日本晴水稻（OryzasativaLcv.Nipponbare)的水稻胚特异表达启动子，本文中 称为0sEmb3或启动子0sEmb3。
[0009] 优选地，所述植物胚和糊粉层特异启动子0sEmb3包含SEQIDNo: 1所示的DNA序 列的变体、同源物或衍生物。所述植物胚和糊粉层特异启动子0sEmb3还包括在高等严谨条 件下能够与SEQIDNo: 1所示的DNA序列或SEQIDNo: 1所示序列的互补DNA序列杂交的 核苷酸序列。
[0010] 另一方面，本发明提供一种表达盒、重组表达载体或转化子，其特征在于，所述表 达盒、重组表达载体或转化子包含所述的植物胚特异表达启动子0sEmb3。在所述重组表达 载体中，所述植物胚特异表达启动子连接于待表达的基因序列的上游；优选地，待表达的基 因为具有改善植物，尤其是水稻在胚部位的性状能力的基因。更优选地，该重组表达载体为 将SEQIDNo: 1所示的序列即0sEmb3或启动子0sEmb3构建于pCAMBIA1391中得到的重组 表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-〇sEmb3。
[0011] 本发明还提供一种上述启动子在改善植物胚部位的性状方面的应用。所述植物胚 特异表达启动子0sEmb3用于驱动外源基因在植物胚部位表达。所述植物为单子叶植物，例 如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。
[0012] 另一方面，本发明提供一种获取所述启动子的方法，所述方法包括如下步骤：
[0013] 步骤⑴制备正向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDN〇:2所示；
[0014] 步骤⑵制备反向引物，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDN〇:3所示；
[0015] 步骤（3)以水稻品种日本晴的DNA序列为模板，利用所述正向引物和所述反向引 物，采用高保真DNA聚合酶对日本晴的DNA序列中的一目的片段进行PCR扩增，该目的片段 的核苷酸序列如SEQIDNo: 1所示；
[0016] 步骤⑷对所述目的片段进行加A并连接PGEM-T-Easy载体；
[0017] 步骤（5)，利用该载体转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞，使感受态细胞激活，进 而将目的片段转入到激活的感受态细胞中；
[0018] 步骤（6)挑取单克隆菌液提质粒，用BamHI和EcoRI进行双酶切验证，将经过鉴定 的阳性克隆进行测序，验证正确的克隆即为所要获得的目的片段一一启动子0sEmb3,其核 酸序列如SEQIDNo: 1所示；
[0019] 步骤（7)，利用AXYGEN胶回收试剂盒回收所述目的片段。
[0020] 本发明中所提供的启动子的DNA序列如SEQIDNo: 1所示，需要说明的是SEQID No: 1中，序列开头部分的"ATTTTTCCGTCACATCGTTTCA"为获得启动子过程中使用的正向引 物的留存序列，共计22bp;序列末尾部分的"GCTGCAGGTGTGCTCGATCCCC"为获得启动子过程 中使用的反向引物的留存序列（该留存序列与反向引物的相应序列互补），共计22bp;该 DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的 启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。
[0021] 本发明的发明人利用SEQIDNo:2所示的正向引物和SEQIDNo:3所示的反向引 物从日本晴水稻（OryzasativaLcv.Nipponbare)中分离克隆0sEmb3基因上游包括转录 起始位点在内的1972bp的DNA序列，并对其进行了验证。
[0022] 技术效果
[0023] 本发明的启动子0sEmb3可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。该 启动子能够调控基因在植株中的胚部位集中表达，在实际应用中具有显著的价值。可以通 过该启动子驱动外源基因在植物中表达，可以提高和改善水稻的特性，从而培育出理想的 转基因植物品种。
【附图说明】
[0024] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0025] 图1为将0sEmb3启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A 为PCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-〇sEmb3示意图，其中示出了利用0sEmb3 启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；
[0026] 图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；
[0027]图3成熟植株（90天）的根（a)、茎（b)、叶（c)、鞘⑷及成熟种子的纵截面（e) 和横截面