一种嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法及应用，属于基因工程与啤酒发酵 领域。
【背景技术】
[0002] 嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase)是一类催化嘌呤核苷及其2' -脱氧嘌呤核苷可逆磷 酸化的酶，属于N-水解和转移酶家族，其广泛分布于各种生物细胞中。根据来源、亚基组 成、分子量和底物特异性等差异可将其主要分为两大类：第一类为高分子量同源六聚体，分 子量约为110_160kDa，其底物特异性较广，能催化6-氨基嘌呤和6-氧嘌呤及其核苷，大肠 杆菌、克雷伯氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等来源的PNPase为该类酶的典型代表。第二类为低 分子量同源三聚体，分子量约为80-100kDa，以6-氧嘌呤及其核苷为底物，通常被称为"肌 苷-鸟苷磷酸化酶"，这类酶多见于一些细菌和哺乳动物中。以外，其他来源的PNPase由于 底物特异性、分子量与上述两类标准差异较大，统称为其他类。
[0003] 啤酒中含有大量的嘌呤类物质（purines)，其含量一般为40mg/L_100mg/L，这些 嘌呤类物质主要是游离态的嘌呤碱基、结合态的嘌呤核苷和嘌呤核苷酸，酵母能且只能利 用游离态的嘌呤碱基。通过对市售啤酒的大量检测，结果表明啤酒中主体嘌呤物质为嘌呤 核苷，嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase)能够将麦汁中的嘌呤核苷分解为游离嘌呤碱基，在发酵 过程中，更多的游离嘌呤碱基被酵母所利用，最终降低啤酒中的嘌呤含量。
[0004] 嘌呤核苷磷酸化酶在野生菌株中含量较少，通过筛选来获得高酶活菌株这一方法 比较困难，因此我们尝试利用基因工程的技术手段来克隆目的基因，以期在宿主菌中可以 得到高水平表达。本发明选取大肠杆菌的PNPase作为表达对象，制得的嘌呤核苷磷酸化 酶，酶活力高，能够将麦汁中的嘌呤核苷水解成游离嘌呤碱基。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法， 用于催化嘌呤核苷水解解生成游离嘌呤碱基。
[0006] 所述嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法，包括如下步骤：
[0007] (1)将核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示的基因，以pET28a(+)为表达载体，以大肠 杆菌BL21 (DE3)为宿主，构建重组菌；
[0008] (2)发酵培养重组菌制备嘌呤核苷磷酸化酶。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养是将重组菌种子液转接到LB/Kar/液 体培养基中，37°C培养至对数生长期中期，加入异丙基-(6-硫代半乳糖苷（IPTG)至终浓度 0? 05mmol/L，30°C诱导培养 4-5h。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养是将重组菌种子液，按1 %接种量转接 到LB/Kaf液体培养基中，37 °C培养至发酵液OD_= 0. 6,加入异丙基-0 -硫代半乳糖苷 (IPTG)至终浓度为 0? 05mmol/L，30°C诱导 4h。
[0011] 本发明还提供一种重组表达嘌呤核苷磷酸化酶的大肠杆菌工程菌，是将核苷酸序 列如SEQIDNO. 1所示的基因，以pET28a(+)为表达载体，以大肠杆菌BL21 (DE3)为宿主构 建得到的。
[0012] 本发明制备得到的嘌呤核苷磷酸化酶可用于催化麦汁中的嘌呤核苷磷酸解生成 游离嘌呤碱基，在啤酒发酵过程中，游离嘌呤碱基被酵母利用，为低嘌呤啤酒的生产提供依 据。
[0013] 本发明构建得到的重组表达嘌呤核苷磷酸化酶的大肠杆菌工程菌，经发酵培养， 嘌呤核苷磷酸化酶的酶活力达到184. 46U/mL，远远高于现有水平。本发明为嘌呤核苷磷酸 化酶在麦汁糖化工艺中的应用提供重要基础。
【附图说明】
[0014] 图1为PMD18-T载体的结构示意图。
[0015] 图2为pET28a(+)质粒连接模式示意图。
[0016] 图3为PCR扩增得到PNPase基因目的条带图；M为Marker;1、2均为PCR扩增产 物；3为阴性对照；4为阳性对照。
[0017] 图4为pET-28a(+)_PNPase酶切鉴定图；M为Marker;1、2均为酶切产物。
[0018] 图5为重组菌中表达产物的凝胶电泳图；图中从左到右依次是Marker、诱导4小 时后破碎沉淀、诱导4小时后破碎上清、诱导4小时后总蛋白、诱导3小时后总蛋白、诱导2 小时后总蛋白、诱导1小时后总蛋白、未诱导前总蛋白、空质粒诱导4小时后总蛋白。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase)基因合成、引物设计和PCR扩增
[0020] 1、根据GenBankM60917. 1提供的PNPase基因序列进行全基因合成，委托上海生 工生物工程公司合成。
[0021] 2、根据上述基因序列设计一对引物，为方便克隆，在上游引物3,端和下游引物的 5,端分别引入HindIII和BamHI酶切位点。
[0022] 上游引物为：5' -CGCGGATCCATGGCTACCC-3'
[0023]下游引物为：5' -CCCAAGCTTCTCTTTATCGCCCAG-3'
[0024] 3、PCR反应，用以上引物扩增编码PNPase(deoD)的CDS序列。
[0025] (I)PCR反应体系如下
[0026] 表1反应体系
[0027]
[0031] 通过PCR扩增的产物，经琼脂糖电泳检测显示，存在PNPase目的片段，结果见图3。
[0032] 实施例2克隆载体的构建
[0033] 1、回收，将PCR反应产物用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒（购自上海生工生物 工程有限公司）回收目的片段，得到较纯的DNA。
[0034] 2、连接，将回收得到的目的片段连接到pMD18-T载体，连接体系如下，16°C条件下 保温过夜。
[0035] 表3连接体系
[0036]
[0038] 3、转化，从LB平板上挑取新活化的E.coliBL21 (DE3)单菌落，接种于5mL的LB/ Amp1'培养基中，37 °C振荡培养过夜。取100yL(1 % -3 %的接种量）培养液转接于5mL的LB/ Amp1'液体培养基中，37°C振荡培养，使OD6。。达到0. 4左右。将培养液1. 5mL转移到Eppendorf 管中，冰浴20min使其停止生长，4°C下，3000r/min离心5min，弃去上清液。添加900yL预 冷的IOOmMCaCl2溶液，并用枪轻轻吹打，冰浴30min后，3000r/min离心5min，尽可能地弃 去上清液。细胞沉淀用60yL预冷的0&(：12溶液悬浮，冰浴放置，备用。
[0039] 取一管100yL的大肠杆菌感受态细胞，加入重组质粒的连接产物8yL，轻轻用抢 吹打混匀，冰浴20min后，42°C保温90s，热击后迅速放入冰中3min。添加ImL的LB培养基， 混匀后37°C振荡培养lh，使细胞恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。 然后3000r/min离心5min，弃去0. 9mL上清液，余下的0.ImL样品用抢轻轻吹勾，吸至LB/ Amp1'培养基平板上，倒置培养，37°C培养16-24h，观察是否有转化菌生成。
[0040] 4、筛选，转化后的细胞在含有氨苄青霉素的LB平板上，37°C倒置培养过夜，以平 板上的菌落作为PCR的模板，PCR反应条件、反应体