一种重组Cu/Zn-SOD的发酵制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一种重组Cu/Zn-SOD的发酵制备方法。 技术背景
[0002] 超氧化物歧化酶（S0D，EC1. 15.I. 1)是机体活性氧自由基清除反应过程中第一个 发挥作用的抗氧化酶，SOD能清除人体自由基，在延缓衰老，以及其他由自由基引起的疾病 如严重危害人体健康的肿瘤、心脑血管疾病、眼部疾病、艾滋病、糖尿病、炎症等方面都有很 好的预防和治疗功效。同时由于SOD具有良好的抗衰老功效，也可应用于化妆品、功能性食 品、口腔产品、日化产品等行业中。
[0003] 按照结合金属离子的种类不同，超氧化物歧化酶可分为四种类型：铜锌超氧化物 歧化酶（Cu/Zn-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD)和镍超氧 化物歧化酶（Ni-SOD)。其中Cu/Zn-SOD广泛存在于大多数的哺乳动物和真菌等真核生物细 胞质、叶绿体和过氧化氢酶体内，是自然界中分布最为广泛的一种超氧化物歧化酶，同时也 是目前应用最为广泛的超氧化物歧化酶。
[0004] 梅花鹿是我国一级重点珍稀保护动物，鹿茸是一种长有茸毛且含有梅花鹿血液 的名贵药材，具有极高的药用价值。崔凯等（2012)从生茸期鹿血中纯化得到比活力为 4122. 74U/mg的鹿血SOD，且鹿血SOD含有2个亚基；张兰杰等（2005)从鹿血红细胞中分离 得到比活力为13707. 27U/mg铜锌超氧化物歧化酶，相对分子质量约为32kDa，相对亚基分 子质量为17kDa。鹿茸的抗氧化作用与鹿血中的超氧化物歧化酶具有一定关系。
[0005] 目前市场上大多数SOD产品主要来源于动物血液、内脏等，由于原材料有限、纯化 困难等原因，导致SOD的纯度低、产量少；特别是随着世界各地疯牛病、禽流感、口蹄疫以及 由动物传播的SARS等恶性传染病的不时报道，生产动物源血液制品的风险加大；此外，对 产品纯度要求的增高也增加了生产成本。天然微生物和植物来源的SOD也因其种类少、表 达量低、酶分子量大、与动物及人体内SOD的同源性低，从而使其难以得到广泛的应用。因 此，寻找优质动物来源的SOD外源基因，构建高效表达系统，是实现SOD产业化生产的重要 途径。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于针对现有SOD产品中SOD的纯度低、产量少，提供一种高纯度重 组Cu/Zn-SOD的发酵制备方法。以高效表达梅花鹿鹿茸来源Cu/Zn-SOD基因的毕赤酵母工 程菌GSl15-pPIC9K为生产菌株，利用微生物工程方法发酵生产重组S0D。通过构建高效表 达系统，可实现SOD产业化生产，能减少对自然资源的依赖，消除动物疾病所带来的负面影 响，提高超氧化物歧化酶的应用安全性。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 梅花鹿鹿茸来源重组Cu/Zn-SOD的发酵制备方法为：以能高效表达梅花鹿鹿茸来源Cu/Zn-SOD基因的毕赤酵母工程菌GSl15-pPIC9K为生产菌株，种子培养采用YH)培养基 (?册.0)，30°(：、20(^/111111培养1511;发酵培养基为811￥(?册.0) ;诱导产酶条件为：接种 量5%，初始甲醇添加量1%，每隔24h补充1%甲醇，200r/min、30°C培养96h，重组SOD活力 为1876U/mL;发酵液经孔径为IOOnm的陶瓷膜微滤除菌，用截留分子量为IOkDa的中空纤 维柱超滤，以除去发酵液中的小分子蛋白、金属离子和色素等物质，并将其浓缩3-5倍；超 滤后样品采用HiTrapDEAEFF弱阴离子交换色谱柱进行分离纯化，吸附缓冲液为pH8.0、 50mmol/LTris-HCl，〇-l.Omol/LNaCl梯度洗脱，流速为lmL/min;收集洗脱峰组分利用 TSK-G3000SW进行凝胶过滤，采用pH7.0,0.lmol/L的磷酸盐缓冲液(含0?lmol/L似2304)进 行洗脱，流速〇. 5mL/min，得到电泳纯Cu/Zn-SOD组分。
[0008] 纯化后的SOD比活力为17647.lU/mg，回收率为36. 84%，纯化倍数为10. 54倍。
[0009] 有益效果在于： 本发明采用基因工程的方法构建能高效表达梅花鹿鹿茸来源Cu/Zn-S0D基因的毕赤 酵母工程菌，通过工程微生物的发酵生产，大量制备Cu/Zn-S0D;不仅能减少对自然资源的 依赖，消除动物疾病所带来的负面影响，提高超氧化物歧化酶的应用安全性；而且，超氧化 物歧化酶产业化的实施将大大降低该酶的生产成本和市场价格，使其应用范围更加广阔， 更有利于服务于全民健康，同时也将带来很好的经济和社会效益。
【附图说明】
[0010] 图1毕赤酵母工程菌在不同种子培养基中的生长情况；纵坐标为发酵液稀释50 倍后OD值； 图2不同培养基初始pH值对毕赤酵母工程菌生长的影响；纵坐标为发酵液稀释50倍 后OD值； 图3不同发酵培养基对重组SOD表达量的影响； 图4不同BMMY培养基初始pH对重组SOD表达量的影响； 图5不同Cu2+浓度对重组SOD表达量的影响； 图6不同Zn2+浓度对重组SOD表达量的影响； 图7不同甲醇添加量对重组SOD表达量的影响； 图8不同接种量对重组SOD表达量的影响； 图9发酵温度对重组SOD表达量的影响； 图10 HiTrap DEAE FF弱阴离子交换色谱洗脱曲线； 图11 DEAE FF弱阴离子交换各色谱峰电泳图；注：1. Protein Marker ;2.样品；3. D1; 4. D2；5. D 3；6. D 4; 图12TSKgelG3000SW高效凝胶色谱洗脱曲线； 图 13 TSK gel G3000SW高效凝胶各色谱峰电泳图；注：1. Protein Marker ;2. DEAE-D2; 3. T1^. T 2;5. T 3；6. T4〇
【具体实施方式】
[0011] 本发明用下列实施例来进一步说明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
[0012] 实验材料和试剂 1、菌株：表达梅花鹿鹿茸来源Cu/Zn-S0D基因的毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K由福 州大学酶工程研究所自行构建。工程菌构建方法见国家发明专利"一种超氧化物歧化酶及 其制备方法"（ZL200910112388.3)。
[0013] 毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K的构建：从梅花鹿鹿茸中分离提取总RNA，将mRNA 反转录为cDNA，PCR扩增后取PCR产物进行电泳检测，回收目的基因；制备双链cDNA进行 亚克隆，将所得目的基因进行DNA序列测定，并在NCBI收据库中进行比对分析，得到Cu/ Zn-SOD基因；Cu/Zn-SOD编码序列经肋〇I和I双酶切后与肋〇I和I双酶切的 pPIC9K质粒连接，得到酵母重组表达质粒pPIC9K-S0D;将制备好的重组质粒pPIC9K-S0D经 AcI酶切，得到线性化质粒pPIC9K-S0D，转化毕赤酵母GS115,挑选阳性克隆子进行诱导表 达。
[0014] 2、主要试剂： 酵母浸膏和胰蛋白胨购自OXOID公司；生物素、无氨基酵母氮源（YNB)、三羟甲基氨基 甲烷（Tris)购自生工生物工程(上海）股份有限公司；甲醇、葡萄糖及其它常规药品均为国 产分析纯试剂。
[0015]3、培养基： YP培养基：酵母浸膏1%，胰蛋白胨2%，121°C灭菌20min; YPD培养基（pH6. 0):在灭菌后的YP培养基中加入10%的10*D; 10*D:20% 葡萄糖，115°C灭菌 30min; YPM培养基：在灭菌后的YP培养基中加入1%纯甲醇； YPDM培养基：在YPM培养基的基础上加入1%葡萄糖； BMGY培养基：0. 5g酵母浸膏、Ig胰蛋白胨，溶解于35mL水中，121°C灭菌20min;无菌 环境下加入l〇*YNB5mL、lmol/L磷酸盐缓冲液5mL、10*甘油5mL、500*生物素0.ImL; BMMY培养基（pH6.0):0. 5g酵母浸膏、Ig胰蛋白胨，溶解于40mL水中，121°C灭菌 20min;无菌环境下加入10*YNB5mL、lmol/L磷酸盐缓冲液5mL、500*生物素0.lmL、纯甲醇 0. 5mL； 10*YNB:溶解13. 4gYNB于IOOmL水中，过滤除菌，4°C存放； 500*生物素：0. 02%生物素于50°C下溶解后过滤除菌，4°C存放； 10*甘油：10%甘油过滤除菌，4°C存放。
[0016]4、色谱柱： HiTrapDEAEFF弱阴离子色谱柱，购自美国GE公司； TSK-gelG3000SW高效凝胶色谱柱，购自日本东V-株式会社（TOSOH)。
[0017] 5、SOD活力测定方法：按照南京建成科技公司超氧化物歧化酶测试盒说明书(货 号：A001-1羟胺法）操作。
[0018] 酶活力单位定义为：每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个 SOD活力单位（U)。
[0019] 酶活力单位计算：
式中： SOD--SOD活力单位（U/mL); OD对照--对照管550mn下吸光值； OD样品--样品管550mn下吸光值； V总--反应液总体积（mL); V样--样品液总体积（mL)。
[0020] 条件优化实验： 1)毕赤酵母工程菌GS115-PPIC9K种子培养基的优化 将毕赤酵母工程菌分别接种于YH)和BMGY培养基中，于30°C、200r/min条件下培养 48h，每隔2h取样测定0D600,比较毕赤酵母工程菌在YH)和BMGY中的生长情况；结果（图 1)显示，无论是YH)还是BMGY培养基，毕赤酵母工程菌