一种dc细胞培养试剂及其培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种DC细胞培养试剂及其培养方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长 的正常调控导致异常增生与分化而形成的新生物。新生物一旦形成，不因病因消除而停止 生长，他的生长不受正常机体生理调节，而是破坏正常组织与器官，这一点在恶性肿瘤尤其 明显。与良性肿瘤相比，恶性肿瘤生长速度快，呈浸润性生长，易发生出血、坏死、溃疡等，并 常有远处转移，造成人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等，最 终造成患者死亡。
[0003] 恶性肿瘤是严重威胁人们生命健康的第一病害，在继切除手术、放疗、化疗之后， 肿瘤免疫细胞治疗是临床用于肿瘤治疗的第四大疗法，它是一种新兴的、具有显著疗效的 肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从 病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机 体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。
[0004]树突状细胞（Dendriticcells,DC)是2011年诺贝尔医学奖得到加拿大科学家拉 尔夫?斯坦曼与1973年发现并命名。DC细胞是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高 效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迀移能力，成熟DC能有效激活初始 型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。DC细胞是已知体内功能最强、唯一 能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过大 量体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞，当细胞数量达到一定数量后回输给病人，可诱导 机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。DC细胞目前已广泛应用于临床肿瘤治疗，结合各类杀伤 性免疫细胞，可以发挥更加高效的肿瘤杀伤效果。
[0005] 目前已有的DC细胞培养最新方案是利用：GM-CSF、IL-4、IL-I和TLR共4类因 子诱导获得，具体流程如下：
[0006] 1.血液分离单个细胞，贴壁获得贴壁单个核细胞，分别添加GM-CSF、E-4的无血 清培养基，诱导培养5-6天；
[0007] 2.添加GM-CSF、IL-4、IL-IP和TLR的无血清培养24-48h，得到成熟的DC细胞。
[0008] 然而，TLR(即toll样受体）是单个的跨膜非催化性蛋白质，可以识别来源于微生 物的具有保守结构的分子。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、粘膜等时，TLR可以识 别它们并激活机体产生免疫细胞应答。只识别来源于微生物的入侵机体的保护，激活DC细 胞后，对人体免疫系统抗肿瘤方面无多大功效。而且，该培养方案制得的成熟DC细胞在递 承肿瘤抗原效果中较弱，回输人体后肿瘤杀伤效果不佳；缺乏激活聚集T细胞于外敏源的 功能，在疾病感染中达不到快速高效的抗原清除功能。因此，急需建立一套DC细胞培养方 案，使得获得的成熟DC细胞能快速递承抗原，并激活和聚集T细胞，达到高效杀伤肿瘤、病 毒微生物等抗原的目的。
【发明内容】
[0009] 有鉴于此，本发明提供了一种DC细胞培养试剂及其培养方法。该方法通过改进DC 细胞培养过程中细胞因子的种类和浓度，促进了DC细胞数量的增殖，并保持较好的细胞活 率，使DC细胞的抗原递呈能力增强，具有更好的抗肿瘤效果。
[0010] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0011] 本发明提供了一种DC细胞培养试剂，DC细胞培养试剂包括第一DC细胞培养试剂 和第二DC细胞培养试剂；
[0012] 第一DC细胞培养试剂包括GM-SCF和IL-4 ;
[0013] 第二DC细胞培养试剂包括GM-SCF、IL-4、TNF-a和MDC。
[0014] 本发明通过改进DC细胞培养过程中细胞因子的种类和浓度，促进了DC细胞数量 的增殖，并保持较好的细胞活率，使DC细胞的抗原递呈能力增强，具有更好的抗肿瘤效果。
[0015] 作为优选，还包括含有血衆的无血清培养基。
[0016] 作为优选，无血清培养基中血衆的体积百分含量为5%~15%。
[0017] 在本发明提供的一些实施例中，无血清培养基中血浆的体积百分含量为5%。
[0018] 在本发明提供的一些实施例中，无血清培养基中血浆的体积百分含量为10%。
[0019] 在本发明提供的一些实施例中，无血清培养基中血浆的体积百分含量为15%。
[0020] 作为优选，血楽:为自体血楽；。
[0021] 本发明还提供了一种DC细胞的培养方法，包括如下步骤：
[0022] 步骤1 :将单个核细胞进行细胞培养，获得贴壁细胞；
[0023] 步骤2:采用第一DC细胞培养试剂培养贴壁细胞，培养4~6天后，采用第二DC细 胞培养试剂培养24~48h，得到DC细胞；第一DC细胞培养试剂为包含GM-SCF和IL-4的 培养基，第二DC细胞培养试剂为包含GM-SCF、IL-4、TNF-a和MDC的培养基。
[0024] 作为优选，第一DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为100~1000U/mL，IL-4的浓 度为 100 ~1000U/mL。
[0025] 在本发明提供的一些实施例中，第一DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为100U/ mL，IL-4 的浓度为 100U/mL。
[0026] 在本发明提供的另一些实施例中，第一DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为 500U/mL，IL-4 的浓度为 500U/mL。
[0027] 在本发明提供的另一些实施例中，第一DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为 1000U/mL，IL-4 的浓度为 1000U/mL。
[0028] 作为优选，第二DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为50~500U/mL，IL-4的浓度 为 50 ~500U/mL，TNF-a的浓度为 1〇〇 ~l〇〇〇U/mL，MDC的浓度为 1 ~20ng/mL。
[0029] 在本发明提供的一些实施例中，第二DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为50U/ mL，IL-4 的浓度为 50U/mL，TNF-a的浓度为l〇〇U/mL，MDC的浓度为Ing/mL。
[0030] 在本发明提供的另一些实施例中，第二DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为 200U/mL，IL-4 的浓度为 200U/mL，TNF-a的浓度为 500U/mL，MDC的浓度为 12ng/mL。
[0031] 在本发明提供的另一些实施例中，第二DC细胞培养试剂中，GM-SCF的浓度为 500U/mL，IL-4 的浓度为 500U/mL，TNF-a的浓度为l〇〇〇U/mL，MDC的浓度为 20ng/mL。
[0032] 作为优选，步骤1中单个核细胞的密度为（2~8)X106/mL，细胞培养的时间为1~ 5h〇
[0033] 作为优选，第一DC细胞培养试剂或第二DC细胞培养试剂中的基础培养基为含有 血浆的无血清培养基，血浆的体积百分含量为5%~15%。
[0034] 作为优选，DC细胞培养试剂中还包括含有血浆的无血清培养基。
[0035] 作为优选，无血清培养基中血衆的体积百分含量为5%~15%。
[0036] 在本发明提供的一些实施例中，无血清培养基中血浆的体积百分含量为5%。
[0037] 在本发明提供的一些实施例中，无血清培养基中血浆的体积百分含量为10%。
[0038] 在本发明提供的一些实施例中，无血清培养基中血浆的体积百分含量为15%。
[0039] 作为优选，血楽:为自体血楽；。
[0040] 在本发明提供的一些实施例中，DC-CIK细胞的培养方法包括如下步骤：
[0041](一）单个核细胞分离：
[0042]1.将外周血或脐带血离心，吸取上层血浆，经灭活后，离心，得到上清血浆；
[0043] 2.取下层血液，加入生理盐水重悬，按稀释后的血液：Ficoll分离液为2:1，把稀 释后的血液缓慢加入到Ficoll分离液上层，使分层清晰；
[0044]3.离心，吸取中间白膜层，即为单个核细胞。
[0045](二）DC细胞分离培养
[0046] 1.获得的单个核细胞加生理盐水稀释后，离心，清洗；
[0047] 2?加无血清培养基（含5%~15%自体血浆）重悬细胞，按（2~8)XIOfVmL接 种，静置1~5h，获得贴壁细胞；
[0048] 3.贴壁细胞加生理盐水轻洗1遍，加入含5%~15%自体血浆的无血清培养基，同 时添加因子GM-SCF为100~1000U/mL，IL-4为100~lOOOU/mL进行培养；
[0049] 4?三天后补加GM-SCF为 100 ~1000U/mL，IL-4 为 100 ~1000U/mL，培养至 4 ~ 6天后换液，同时添加GM-SCF为50~500U/mL，IL-4为50~500U/mL、TNF-a为1〇〇~ 1000U/mL、MDC为 1 ~20ng/mL，培养 24 ~48h，得到DC细胞。
[0050] 本发明还提供了一种DC-CIK细胞的培养方法，采用本发明提供的DC细胞的培养 方法获得的DC细胞制备DC-CIK细胞。
[0051] 本发明提供了一种DC细胞培养试剂及其培养方法。该DC细胞培养试剂包括第一 DC细胞培养试剂和第二DC细胞培养试剂；第一DC细胞培养试剂包括GM-SCF和IL-4;第二DC细胞培养试剂包括GM-SCF、IL-4、TNF-a和MDC。本发明具有如下有益效果：
[0052] 1、本发明通过改进DC细胞培养过程中细胞因子的种类和浓度，促进了DC细胞数 量的增殖，并保持较好的细胞活率和纯度，40mL外周血通过本发明方法获得的DC细胞第7 天时细胞数量可达2. 68XIO7~2. 79X107,活率可保持在97. 2%~98. 0%;
[0053] 2、通过本发明方法获得的DC细胞的抗原递呈能力增强，本发明实施例3提供的培 养方法得到的DC细胞的CD86+效应细胞比例为84. 4%，具有更好的抗肿瘤效果。
【附图说明】
[0054] 图1示流式细胞仪检测结果；其中，1-1示组Al中阴性对照组检测细胞数量，1-2 示组Al中⑶86+效应细胞含量，1-3示组B3中阴性对照组检测细胞数量，1-4示组B3中 ⑶86+效应细胞含量。
【具体实施方式】
[0055] 本发明公开了一种DC细胞培养试剂及其培养方法，本领域技术人员可以借鉴本 文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术 人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳 实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方 法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0056] 术语解释：
[0057] GM-CSF:GM_CSF(人粒细胞-巨噬细胞集弱刺激因子），能刺激粒细胞及巨噬细胞 等白细胞的增殖、分化及活化作用，从而增强造血功能。它也能增强中性粒细胞，嗜曙红细 胞及单核细胞的多种功能。它还能促使效应细胞增强如吞噬细菌及消灭癌细胞等免疫活 动。
[0058] IL-4 :白细胞介素4,是促进B细胞增殖的因子，是T细胞自身分泌的生长因子，在 DC细胞培养中，可以抑制铁壁的单个核细胞朝巨噬细胞分化。
[0059] TNF-a:肿瘤坏死因子-a(TumorNecrosisFactor，简写TNF)是一种能够直接 杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，是迄今