一种肿瘤抗原诱导的dc-cik细胞的制备方法及应用
【技术领域】 [0001] 本发明涉及生物，尤其涉及一种肿瘤抗原诱导的DC-CIK细 胞的制备方法及应用。
【背景技术】 [0002] DC细胞是"DendriticCells"的缩写，中文全称为"树突状细胞"，因 其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC细胞是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿 大籍科学家RalphM.Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞 (AntigenPresentingCells,APC)。已证实，DC细胞是唯一能够显著刺激初始T细胞增殖 的APC，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等）仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC 细胞是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。
[0003]CIK细胞是"Cytokine-InducedKillerCells"的缩写，中文全称为"细胞因子诱 导的杀伤细胞"。CIK细胞是单个核细胞在⑶3单抗和多种细胞因子（包括IFN-y，IL-2 等）的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T 淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞（自然杀伤细胞）的非MHC(主要组织相容性 抗原）限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外 可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。
[0004] DC细胞与CIK细胞具有协同作用，共同孵育后，DC细胞表面共刺激分子的表达及 抗原递呈能力均明显提高，而CIK细胞的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此 DC-CIK较单独的DC或CIK治疗更为有效。
[0005] 虽然通过常规培育方法获得的DC-CIK细胞治疗较单独的DC或CIK细胞治疗更为 有效，但是通过目前培育方法获得DC-CIK细胞只具有非特异性的肿瘤杀伤能力。
[0006]
【发明内容】
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种治疗效果好，且 具有特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用的肿瘤抗原诱导的DC-CIK细胞的制备方法及应 用。
[0007] 本发明的技术方案为：
[0008] -种肿瘤抗原诱导的DC-CIK细胞的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0009] 步骤1、采用血细胞分离机采集肿瘤患者自体外周血单个核细胞，用0. 9%生理盐 水洗涤后，采用无血清A頂-V培养基调节细胞密度至1~2XIO6个/mL;
[0010] 步骤2、将细胞接种于培养瓶，并将培养瓶置于37°C、5%CO2培养箱孵育2小时后， 收集贴壁细胞及悬浮细胞；
[0011] 步骤3、将贴壁细胞置于培养瓶中，并加入DC诱导培养液，然后将培养瓶置于 37°C、5%CO2培养箱中诱导，第3天补加DC诱导培养液，第5天加入肿瘤特异性抗原，第6 天加入TNF-a诱导DC成熟，第7天收获具有肿瘤特异性抗原的成熟DC细胞；
[0012] 步骤4、将悬浮细胞重悬于无血清A頂-V培养基中，调整细胞密度至1~2XIO6个 /mL，并添加终浓度为lOOOU/mL的IFN-y，然后将培养基置于37°C、5% 0)2培养箱中孵育， 第2天添加5 %的自体血浆、终浓度为lOOU/mL的IL-Ia、终浓度为lOOOU/mL的IL-2、终浓 度为〇. 5yg/mL的⑶3单抗，培养至第5天，补充添加含有IL-2浓度为lOOOU/mL的无血清 AM-V培养基；第7天收获CIK细胞；
[0013] 步骤5、将收获的具有肿瘤特异性抗原的成熟DC细胞和CIK细胞混合培养，得到 DC-CIK细胞。
[0014] 本发明米用上述的制备方法，在步骤1中米用无血清AIM-V培养基，与现有米用胎 牛血清培养基相比，避免培养的DC-CIK细胞出现异源血清残留，在细胞回输治疗过程中， 对患者产生严重的免疫反应；实现安全培养DC-CIK细胞。
[0015] 在步骤4中，加入自体血浆进行培养，可以更加有利于自体CIK细胞的增值和分 化。
[0016] 在步骤3中，加入肿瘤特异性抗原对DC细胞诱导，可快速扩增获得大量具有非特 异性肿瘤杀伤活性的DC-CIK细胞，同时赋予DC-CIK细胞特定肿瘤的杀伤活性，使DC-CIK 细胞对特定肿瘤杀伤活性更强。
[0017] 优选的，所述步骤3中，所述DC诱导培养液含rhGM-CSF100ng/mL、rhIL-4 50ng/ mL〇
[0018] 优选的，所述步骤3中加入的肿瘤特异性抗原终浓度为20yg/mL。
[0019] 优选的，所述步骤3中加入的TNF-a终浓度为500U/mL。
[0020] 更优选的，所述步骤3具体为：将贴壁细胞置于培养瓶中，并加入DC诱导培养液， 所述DC诱导培养液含rhGM-CSFlOOng/mL、rhIL-4 50ng/mL，然后将培养瓶置于37°C、5% CO2培养箱中诱导，第3天补充添加DC诱导培养液，第5天加入终浓度为20yg/mL的肿瘤 特异性抗原，第6天加入终浓度为500U/mL的TNF-a诱导DC成熟，第7天收获具有肿瘤特 异性抗原的成熟DC细胞。
[0021] 优选的，所述步骤5为：第7天将收获的带有肿瘤特异性抗原的DC细胞加入到CIK 细胞悬液中，CIK细胞与DC细胞按数量比10:1的比例混合培养，此后每2-3天补加含有 IL-2浓度为lOOOU/mL的无血清A頂-V培养基，共培养5天后得到DC-CIK细胞。
[0022] 更为具体的，本发明所述的肿瘤抗原诱导的DC-CIK细胞的制备方法，其包括以下 步骤：
[0023] 步骤1、采用血细胞分离机采集肿瘤患者自体外周血单个核细胞，用0. 9%生理盐 水洗涤后，采用无血清A頂-V培养基调节细胞密度至1~2XIO6个/mL;
[0024] 步骤2、将细胞接种于培养瓶，并将培养瓶置于37°C、5%CO2培养箱孵育2小时后， 收集贴壁细胞及悬浮细胞；
[0025] 步骤3、将贴壁细胞置于培养瓶中，并加入DC诱导培养液，所述DC诱导培养液含 rhGM-CSFlOOng/mL、rhIL-4 50ng/mL，然后将培养瓶置于37°C、5%CO2培养箱中诱导，第 3天进行补加DC诱导培养液，第5天加入终浓度为20yg/mL的肿瘤特异性抗原，第6天加 入终浓度为500U/mL的TNF-a诱导DC成熟，第7天收获具有肿瘤特异性抗原的成熟DC细 胞；
[0026] 步骤4、将悬浮细胞重悬于无血清A頂-V培养基中，调整细胞密度至1~2XIO6个 /mL，添加终浓度为lOOOU/mL的IFN-y，然后将培养基置于37°C、5%CO2培养箱中孵育，第 2天添加5%的自体血浆、终浓度为lOOU/mL的IL-Ia、终浓度为lOOOU/mL的IL-2、终浓度 为0. 5yg/mL的⑶3单抗，培养至第5天补加含有IL-2浓度为lOOOU/mL的无血清A頂-V 培养基；第7天收获CIK细胞；
[0027] 步骤5、第7天将收获的带有肿瘤特异性抗原的DC细胞加入到CIK细胞悬液中， CIK细胞与DC细胞按数量比10:1的比例混合培养，此后每2-3天补加含有IL-2浓度为lOOOU/mL的无血清A頂-V培养基，共培养5天后得到DC-CIK细胞。本发明还提供了 一种肿 瘤抗原诱导的DC-CIK细胞的应用，所述肿瘤抗原诱导的DC-CIK细胞应用于制备抗肿瘤药 物。
[0028] 本发明的制备方法制备的DC-CIK细胞增殖活性高，其增殖倍数平均高达 229. 85± 1. 31，是传统方法获得的DC-CIK增殖倍数的2. 4倍，具体数值参见表1。同时，本 发明加入肿瘤特异性抗原对DC细胞诱导，赋予DC-CIK细胞特定肿瘤的杀伤活性，使DC-CIK 细胞对特定肿瘤杀伤活性更强，最高可以提高肿瘤杀伤活性20%~40%。本发明将受到不 同肿瘤抗原刺激的DC细胞，在和CIK细胞共培养后可以明显促进DC-CIK细胞的成熟，而且 可以大大提高DC-CIK细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤能力。在DC-CIK回输30天后，肿瘤患 者T淋巴细胞和NK细胞均显著升高，病情得到明显改善。因此，负载特异抗原的DC-CIK细 胞可以用于相关抗肿瘤药物的应用。
【附图说明】
[0029] 图1为本发明DC-CIK细胞的制备流程图。
【具体实施方式】 [0030] 下面结合对本发明作进一步详细的说明。
[0031] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合【具体实施方式】并参 照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发 明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的 概念。
[0032] 本发明提供一种肿瘤抗原诱导的DC-CIK细胞的制备方法，所述制备方法包括以 下步骤：
[0033] 步骤1、采用血细胞分离机采集肿瘤患者自体外周血单个核细胞，用0. 9%生理盐 水洗涤后，采用无血清A頂-V培养基调节细胞密度至1~2XIO6个/mL;
[0034] 步骤2、将细胞接种于培养瓶，