诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基和方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分 化的培养基和方法。
【背景技术】
[0002] 角膜上皮细胞层位于角膜外表面，由4~5层非角化鳞状上皮细胞组成，在维持眼 表稳态以及角膜透明度中发挥重要作用。健全的角膜上皮细胞是角膜抵御外界各种有害因 素损伤的重要条件。结构与功能健全的角膜缘干细胞是角膜上皮细胞再生的主要来源，多 种致病因素如眼外伤、手术创伤、炎症、药物毒性均可造成角膜缘损伤，造成角膜缘干细胞 功能障碍，导致上皮细胞缺失，从而导致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危险。因此，通 过体外培养获得大量用于角膜修复的上皮细胞这一难题亟待解决。
[0003] 临床研究表明，通过体外培养自体角膜缘干细胞作为角膜上皮修复的种子细胞 取得了良好疗效。角膜缘干细胞同其它干细胞一样具有分化程度低、细胞周期长、高度增 殖潜能、自我更新能力和应激增殖等特征，并且研究发现体外培养的角膜缘干细胞可能会 失去部分抗原性，有利于临床移植。也有研究表明，通过建立角膜上皮细胞系（corneal epithelialcellline)能够长期稳定地为不同研究目的提供所需的细胞，如上皮的增殖、 分化、眼科用药的测试、角膜疾病新的治疗方法的开发等等。
[0004] 但是，自体角膜缘干细胞体外连续培养所要求的培养液成分复杂，细胞不稳定易 分化，细胞不能持续扩增，细胞表型发生改变，所以每次移植都要在患者或其家属的正常角 膜上取下部分角膜缘组织进行体外培养，操作繁琐，且给患者带来二次痛苦，并且有研究者 发现当取供眼角膜缘组织大于三分之二时，将造成健眼的眼表疾病和视力不可逆的下降， 使得大多数患者难以接受。因此，非常有必要寻找新的自体和异体移植的细胞来源。
[0005] 脐带间充质干细胞（hUC-MSCs)具有的低污染、来源充足、增殖旺盛等优点，并且， 脐带间充质干细胞不受任何伦理及法理限制，因而吸引了众多的研究者。但是，体外诱导 hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化十分困难。
[0006] 因此，建立体外诱导hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化的有效方法十分必要。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮 细胞分化的培养基和方法，本发明提供的诱导培养基能够和诱导方法能够成功将hUC-MSCs 诱导分化为角膜上皮细胞，诱导分化率可达26 %。
[0008] 本发明提供的诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基，包括基础培 养液、表皮生长因子和胰岛素。
[0009] 表皮生长因子（EGF)能够促进表皮细胞的分裂，胰岛素能够促进细胞对葡萄糖、 氨基酸的代谢，提高细胞的生长状态。本发明在基础培养液中添加表皮生长因子和胰岛素， 从而提高hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化的百分率。实验表明，添加表皮生长因子和胰岛素 的实验组hUC-MSCs向角膜上皮细胞的分化率可达26%，而不添加表皮生长因子或胰岛素 的对照组分化率仅为5. 47%。说明通过添加EGF和胰岛素能够显著提高hUC-MSCs向角膜 细胞分化的效率。
[0010] 在本发明的实施例中，表皮生长因子与胰岛素的质量比为（5~25) : (5000~ 25000)〇
[0011] 在一些实施例中，表皮生长因子与胰岛素的质量比为2:3000~3:2000。
[0012] 在其中一个实施例中，表皮生长因子与胰岛素的质量比为1:1000。
[0013] 在本发明的实施例中，表皮生长因子的含量为5ng/mL~25yg/mL;胰岛素的含量 为 5ng/mL~25yg/mL〇
[0014] 在一些实施例中，表皮生长因子的含量为5ng/mL;胰岛素的含量为5yg/mL。
[0015] 在一些实施例中，表皮生长因子的含量为lOng/mL;胰岛素的含量为10yg/mL。
[0016] 在一些实施例中，表皮生长因子的含量为lOng/mL;胰岛素的含量为15yg/mL。
[0017] 在一些实施例中，表皮生长因子的含量为15ng/mL;胰岛素的含量为10yg/mL。
[0018] 在一些实施例中，表皮生长因子的含量为25ng/mL;胰岛素的含量为25yg/mL。
[0019] 在本发明的实施例中，基础培养液为人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培 养基，人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基的体积比为（50~60) : (44~50)。
[0020] 在一些实施例中，人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基的体积比为 55:45。
[0021] 本发明所用的人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基可为自制也可为 购买获得，本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。其中，人干细胞无血 清培养基适宜培养干细胞，本发明采用的人干细胞无血清培养基为LonzaUltra⑶LTURE?。 角朊细胞无血清培养基适宜培养上皮细胞，本发明采用的角朊细胞无血清培养基为KSFM 培养液。本发明采用的基础培养液皆不含有异源血清，降低了动物源血清给人体带来的风 险。
[0022] 在本发明的实施例中，本发明提供的培养基中还包括青霉素和链霉素。
[0023] 在一些实施例中，青霉素的含量为100U/mL，链霉素的含量为100U/mL。
[0024] 本发明还提供了诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法，将脐带间充 质干细胞与羊膜上皮细胞共培养；培养的培养基为本发明提供的培养基。
[0025] 在本发明的实施例中，共培养为间接共培养。
[0026] 细胞共培养技术是将两种或两种以上的细胞共同培养于同一环境中的技术，由于 其具有更好的反映体内环境的优点，因此被应用于现代细胞研究中。间接共培养体系即将 2中或2中以上的细胞分贝接种于不同的载体上，然后将这两种载体置于同一培养环境中， 是不同种类的细胞共用同一种培养体系而不直接接触。间接共培养可采用transwell小 室。
[0027] 本发明通过实验表明，将脐带间充质干细胞和羊膜上皮细胞共培养，7天后脐带间 充质干细胞部分呈分化趋势，细胞呈散在分布，经检测，hUC-MSCs分化为角膜上皮细胞的分 化率可达26%。而没有进行共培养的且不添加生长因子的对比例中hUC-MSCs的分化率为 2. 7%;采用本发明提供培养基而不进行共培养的对比例中hUC-MSCs的分化率为7. 95%; 培养基中不添加生长因子但采用共培养的对比例中，hUC-MSCs的分化率为5. 47%。可见， 本发明提供的方法能够将hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化的百分率提高近10倍，该效果具 有显著性差异（P〈〇.〇l)。
[0028] 本发明提供的培养基包括基础培养液、表皮生长因子和胰岛素。
[0029] 在本发明的实施例中，脐带间充质干细胞与羊膜上皮细胞的个数比为（1~ 1. 5) : (4 ~6)〇
[0030] 在本发明的实施例中，脐带间充质干细胞为第3~5代；所述羊膜上皮细胞为第2 代。
[0031] 在本发明的实施例中，脐带间充质干细胞的原代分离方法为组织块培养法；羊膜 上皮细胞的原代分离方法为酶消化法。
[0032] 具体的，hUC-MSCs的原代分离方法包括以下步骤：
[0033] 步骤1 :将脐带用含有lOOU/mL青霉素和lOOU/mL链霉素的PBS缓冲液漂洗2次， 以体积分数为75%的乙醇水溶液浸泡Imin~2min后，去除脐带外膜和血管；
[0034] 步骤2:以人干细胞无血清培养液培养，培养条件为5%C02、37°C、湿度95%;第 5~7天半量换培养基，继续培养12~14天后全量换液去掉组织块，收集细胞传代培养。
[0035] 具体的，羊膜上皮细胞的原代分离方法包括以下步骤：
[0036] 步骤1 :将羊膜用含有lOOU/mL青霉素和lOOU/mL链霉素的PBS缓冲液漂洗2次 后，破碎，以质量分数为〇. 25 %胰蛋白酶消化；
[0037] 步骤2 :以胶原酶II和Dnas酶消化后，培养。
[0038] 胶原酶II的浓度为2. 5g/L;Dnas酶的浓度为0? 05g/L;消化的条件为37 °C， 200rpm震荡，时间为15min~30min。
[0039] 培养的培养液为包含表皮生长因子的角朊细胞无血清培养基；其中表皮生长因子 的浓度为lOng/mL~15ng/mL。
[0040] 培养的接种密度为IXIO7个/L。
[0041] 培养的条件为5%C02、37°C、湿度95%培养2h后，去除未贴壁的细胞后继续培养 24小时。
[0042] 在本发明的实施例中，共培养的时间为7天。
[0043] 本发明提供了诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基和方法，本发 明在基础培养液中添加表皮生长因子和胰岛素，从而提高hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化 的百分率。并且，该培养液中不含有异源血清，降低了风险。而本发明提供的方法将脐带间