的偶联物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种维生素B族维生素的偶联物及其制备方法与应用，尤其涉及一种 维生素&的偶联物及其制备方法与应用。属于营养素免疫检测领域。
【背景技术】
[0002] 本发明涉及的下列名称适用于整个说明书和权利要求书： BSA:血清蛋白（BovineSerumAlbumin)，Sigma公司产品 PBS:磷酸缓冲液（PhosphateBufferedSaline)(0.01M，pH=7.40) Sephadex_G75 :葡聚糖凝胶，Sigma公司产品cBSA:经乙二胺修饰的牛血清蛋白 透析膜：索莱宝科技有限公司 维生素B2:Sigma公司产品 ⑶I:N，N' -羰基二咪唑，Sigma公司产品 DMAP:4_二甲氨基P比啶，Sigma公司产品。
[0003] 维生素B2，又名核黄素，早在1879年就被英国化学家布鲁斯于牛奶中发现，它是黄 素辅酶的重要组成部分，主要参与细胞呼吸链的氢传递过程。饮食中缺乏维生素B2可能造 成皮肤及粘膜炎症、贫血、以及畏光等症状。最近有报道指出，维生素B2还参与核酸修复过 程以及细胞凋亡过程。由于维生素B2无法由人体自身合成，并且无法在体内蓄积，因此只 能从日常饮食中摄取维生素B2。含维生素^较多的食物有动物肝脏、蛋黄、牛奶、鳝鱼等。 维生素B2的日常建议摄入量为男士1.3mg/天，女士I.Img/天。在儿童发育期、妇女哺 乳期、创伤、患有慢性消耗性疾病时，由于机体需求量增大，日常饮食摄入可能无法满足机 体需要，可能会造成维生素B2缺乏症，此时需适当补充维生素B2。美国和加拿大人口的日 平均摄入量为男性2mg/天，女性1.5mg/天。95%的美国人口每天从食物和保健品中摄 入的维生素B2为4-10mg/天。虽然人体排泄维生素B2的能力较强，但大量摄入维生素B2 仍有可能对肾功能产生影响。而维生素B2在中国的平均摄入量只有0.9mg/天，低于推荐 的标准。因此，在儿童成长过程中检测维生素&是十分必要的。
[0004] 微生物法是维生素检测中历史久远的经典分析手段，它利用某类微生物对特定营 养物质的特殊依赖作用进行检测。现今的许多标准中，仍将微生物法作为维生素检测的 首选方法，如AOAC(AssociationofOfficialAnalyticalChemists)、AACC(American AssociationofCerealChemists)等。但是，由于检测原理的特点，微生物法有着自身的 局限与不足。首先，微生物法较其他分析方法耗时更长。由于分析结果由相应微生物的生 长程度来指征，因此需预留微生物生长的足够时间，检测一般需要4到6天。第二，微生物 法由于涉及微生物培养，对操作环境有一定的要求。第三，步骤繁琐，即便是商品化的微生 物法试剂盒，在使用时也要进行严格的样品前处理、培养基配置、结果处理等等。因此，微生 物法已渐渐被其他分析方法所取代。仪器分析方法如高效液相色谱法是应用广泛的方法。 这些方法准确、稳定、可靠，可以作为标准方法。但仪器法价格昂贵，费时较长，且造成有机 溶剂污染，需要大型仪器设备，需要专门的技术人员。酶联免疫检测法（ELISA)提供了一种 极好的检测手段。该法具有快速，准确，简易，不需要专门人员操作等优点，这使得ELISA法 成为一种理想的，可用于常规检测方法。酶联免疫检测法的核心是需要高质量的抗体。大 部分维生素都是小分子有机化合物，不具有免疫原性，称之为半抗原。所以，必须把这些化 合物转变为能引发动物免疫系统产生抗体的免疫原(又称之为完全抗原)。经检索，目前世 界上尚未有维生素B2的免疫原的合成及抗体制备的报道，因此研究维生素B2的免疫原的合 成及抗体制备就显得十分必要。
【发明内容】
[0005] 针对上述现有技术的不足，本发明要解决的问题是：提供一种能引发动物免疫系 统产生针对维生素B2有特异反应的抗体的免疫原，即维生素B2的偶联物及其制备方法。同 时，本发明还提供了所述的维生素B2的偶联物作为免疫原在制备维生素1特异反应抗体中 应用。
[0006] 本发明的维生素82的偶联物，由维生素B2半抗原与产生抗原性的载体物质牛血清 蛋白或卵清蛋白偶联构成。
[0007] 其中：上述产生免疫原性的载体物质优选是牛血清蛋白。
[0008] 本发明所述的维生素82的偶联物，其结构通式如（I)
(I) 其中m为与一个牛血清蛋白分子结合的维生素B2的分子个数，所述n为整数1~20，BSA为牛血清蛋白（Bovineserumalbumin)，分子量范围 6. 6KDa~6.9Kda; 上述偶联物显示出如下物化特征： (1) 外观：白色粉末固体； (2) 紫外吸收光谱：373nm，445nm 上述的维生素82的偶联物，其特征是：所述n为整数5~15,BSA分子量范围 6. 6KDa~6. 9Kda 上述的维生素B2的偶联物的制备方法是：将维生素B2与产生免疫原性的载体物质连接 起来，结合为具有诱发动物免疫产生抗体的偶联物，并保持该偶联物的生物活性不变。
[0009] 上述的维生素B2的偶联物的制备方法，由如下步骤完成： (1) 溶液A的制备：将维生素B2,N，N'_羰基二咪唑（⑶1)，4_二甲氨基吡啶（DMP)以 摩尔比1:2~8:0. 2 ~1溶解于二甲基甲酰胺中，反应生成维生素82与N，N' -羰基二咪唑的 活性中间体，备用； (2) cBSA的制备：在0~4°C条件下，先将乙二胺溶于pH为7. 38~7. 56,浓度为 0. 01M~0. 02M磷酸缓冲溶液中，用浓盐酸调pH为7. 38~7. 56;以乙二胺：BSA:EDC的摩尔 比为15~25: 1: 15~25的量称取BSA和EDC，然后加入乙二胺溶液中，在20±5°C条件下搅 拌反应2~4小时；将乙二胺与BSA的反应溶液在0~4°C条件下，用上述磷酸缓冲液搅拌透析 70~80小时，然后改用蒸馏水透析20~30小时，每6小时更换一次透析液；在0~4°C，以13000 转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；冻干上清液，得到白色粉末固体cBSA， 备用； (3) 溶液B的配置：把cBSA溶于pH为7. 38~7. 56,浓度为0? 01M~0. 02M磷酸缓冲溶液 中，配成10. 〇±5. 0mg/ml的溶液，备用； (4) 按维生素82与cBSA的摩尔比为15~50:1量分别取溶液A和溶液B，在20°C±5°C 温度下，把溶液A逐滴加入到不断搅拌状态下的溶液B中，反应4~6小时，得到溶液C; (5) 溶液C用上述磷酸缓冲液搅拌透析70~80小时，再改用蒸馏水透析20~30小时，每 6小时更换一次透析液；然后在0~4°C下，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分 钟，取上清液； (6) 冻干上清液，得到白色维生素B2的偶联物。
[0010] 在上述的维生素&的偶联物的制备方法中：步骤（1)所述的维生素B2，N，N' -羰基 二咪唑（⑶I)，4-二甲氨基吡啶（DMP)的摩尔比优选为1:5:1。
[0011] 在上述的维生素&的偶联物的制备方法中：步骤（2)所述乙二胺与牛血清蛋白、 EDC的摩尔比为20:1:20。
[0012] 在上述的维生素82的偶联物的制备方法中：步骤（2) (3)所述的磷酸缓冲液pH优 选为7. 40,浓度优选为0. 01M。
[0013] 在上述的维生素82的偶联物的制备方法中：步骤（4)所述维生素B2与牛血清蛋白 的摩尔比为30:1。
[0014] 本发明所述的维生素B2的偶联物作为免疫原在制备维生素B2特异反应抗体中的 应用。
[0015] 利用本发明的技术方案可以成功地把半抗原维生素B2与载体蛋白特别是牛血清 蛋白BSA偶联起来，从而合成了能够在动物体内引发免疫反应，产生抗体的完全免疫原一 维生素B2的偶联物。
[0016] 利用本发明所述的维生素B2的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔，成功地获得 了对半抗原维生素B2有特异反应的抗体。经ELISA实验鉴定，利用本发明所述的维生素B2 的偶联物作为免疫原制备的维生素B2特异反应抗体，其抗血清效价达到1: 64000,其最低 检测限为1. 07ng/mL。
[0017]上述的维生素B2的偶联物以及高效价的维生素B2特异反应抗体的制备成功，为 制备维生素B2的酶联免疫检测试剂盒提供了基础。在实际应用中，把所述制备的维生素B2 特异反应抗体镀在微孔盘内，就可以快速检测儿童血样中维生素B2的含量。由于本发明所 述方法具有简易，快速，特异，准确的特点，所以可以用于儿童血样中维生素B2的含量测定。 这样不但可以节省大量的检测时间，还可以用于现场操作，从而弥补了仪器法费时较长，需 要大型仪器设备支持，需要专门的技术人员操作，难用于现场的不足。所以，半抗原维生素 8 2与载体蛋白特别是牛血清蛋白BSA偶联物的合成及抗血清的成功制备为这种快速检测法 奠定了基础。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1 (1) 溶液4的制备：将维生素8219.4 11^，1^-羰基二咪唑（〇)1)25.0 11^，4-二甲氨 基吡啶（DMAP)0.6mg溶解于4ml二甲基甲酰胺中，反应生成维生素82与乂^_羰基二咪 唑的活性中间体，备用； (2)cBSA的制备：在0~4°C条件下，先将乙二胺18.0mg溶于20mlpH为7. 40,浓度为 0?OlM磷酸缓冲溶液中，用浓盐酸调pH为7. 40 ;分别称取1000. 0mgBSA(分子量68, 000) 和57. 51mgEDC，然后加入乙二胺溶液中，在20°C条件下搅拌反应2小时；将乙二胺与BSA 的反应溶液在〇~4°C条件下，用上述磷酸缓冲液搅拌透析70小时，然后改用蒸馏水透析24 小时，每6小时更换一次透析液；在0~4°C，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分 钟，取上清液；冻干上清液，得到白色粉末固体cBSA，备用； (3) 溶液B的配置：把cBSA溶于pH为7. 40,浓度为0.OlM磷酸缓冲溶液中，配成10. 0 mg/ml的溶液，备用； (4) 按维生素&与cBSA的摩尔比为20:1量分别取溶液A和溶液B，在20°C温度下，把 溶液A逐滴加入到不断搅拌状态下的溶液B中，反应6小时，得到溶液C; (5) 溶液C用上述磷酸缓冲液搅拌透析70小时，再改用蒸馏水透析24小时，每6小时 更换一次透析液；然后在〇~4°C下，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上 清液； (6) 冻干上清液，得到白色维生素B2的偶联物。
[0019] 实施例2 (1) 溶液4的制备：将维生素8219.4 11^，1^-羰基二咪唑（0)1)30.〇11^，4-二甲氨 基吡啶（DMP)LOmg溶解于5ml二甲基甲酰胺中，反应生成维生素82与乂^_羰基二咪 唑的活性中间体，备用； (2)cBSA的制备：在0~4°C条件下，先将乙二胺18.0mg溶于20mlpH为7. 40,浓度为 0?OlM磷酸缓冲溶液中，用浓盐酸调pH为7. 40 ;分别称取1000. 0mgBSA(分子量68, 000) 和57. 51mgEDC，然后加入乙二胺溶液中，在20°C条件下搅拌反应2小时；将乙二胺与BSA 的反应溶液在〇~4°C条件下，用上述磷酸缓冲液搅拌透析70小时，然后改用蒸馏水透析30 小时，每6小时更换一次透析液；在0~4°C，以13000转/分钟离心上述透析